細胞破碎與固液分離技術(shù)

第一章細胞破碎與固液分離技術(shù)第一章細胞破碎與固液分離技術(shù)第一節(jié)

發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)

第二節(jié)

固液分離第三節(jié)細胞壁的破碎第四節(jié)包涵體

第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)

一、預(yù)處理的原理及方法1．降低液體粘度

由流體力學(xué)基本知識可知，濾液通過濾餅的速率與液體的粘度成反比，可見降低液體粘度可有效提高過濾速率。降低液體粘度常用的方法有加水稀釋法和加熱法。

加水稀釋法可有效降低液體粘度，但會增加懸浮液的體積，使后處理任務(wù)加大，并且只有當(dāng)稀釋后過濾速率提高的百分比大于加水比時，從經(jīng)濟上才能認(rèn)為有效。

第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)

升高溫度可有效降低液體粘度，從而提高過濾速率，常用于粘度隨溫度變化較大的流體。另外，應(yīng)用加熱法的同時，可控制適當(dāng)溫度和受熱時間，使蛋白質(zhì)凝聚形成較大顆粒，進一步改善發(fā)酵液的過濾特性。如鏈霉素發(fā)酵液，調(diào)酸至pH3.0后，加熱至70℃，維持半小時，液相粘度下降至1/6，過濾速率可增大10～100倍。使用加熱法時必須注意：①加熱的溫度必須控制在不影響目的產(chǎn)物活性的范圍內(nèi)；②對于發(fā)酵液，溫度過高或時間過長，可能造成細胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，而增加發(fā)酵液的復(fù)雜性，影響其后的產(chǎn)物分離與純化。第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)2．調(diào)整pH

pH直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH可改善其過濾特性。對于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)作為雜質(zhì)存在于液體中時，常采用調(diào)pH至等電點使兩性物質(zhì)沉淀。另外，在膜分離中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，常通過調(diào)整pH，改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，以減少吸附造成的堵塞和污染。此外，細胞、細胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個pH下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于固液分離。

第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)3．凝聚和絮凝凝聚和絮凝的主要作用為增大混合液中懸浮粒子的體積，提高固液分離速度，同時可除去一些雜質(zhì)。（1）凝聚作用

凝聚作用是指在某些電解質(zhì)作用下，使膠體粒子聚集的過程。這些電解質(zhì)稱為凝聚劑。膠體粒子能保持分散狀態(tài)的原因是其帶有相同電荷和擴散雙電層的結(jié)構(gòu)。當(dāng)分子熱運動使粒子間距離縮小到使它們的擴散層部分重疊時，即產(chǎn)生電排斥作用，使兩個粒子分開，從而阻止了粒子的聚集。雙電層電位越大，電排斥作用就越強，膠粒的分散程度也越大，發(fā)酵液越難過濾。

第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)膠粒能穩(wěn)定存在的另一個原因是其表面的水化作用，使粒子周圍形成水化層，阻礙了膠粒間的直接聚集。凝聚劑的加入可使膠粒之間雙電層電位下降或者使膠體表面水化層破壞或變薄，導(dǎo)致膠體顆粒間的排斥作用降低，吸引作用加強，破壞膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，導(dǎo)致顆粒凝聚。影響凝聚作用的主要因素是無機鹽的種類、化合價及無機鹽用量等。第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)常用的凝聚劑有AlCl3·6H2O、Al2(SO4)3·18H2O、K2SO4·Al2(SO4)3·24H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、ZnSO4和MgCO3等。電解質(zhì)凝聚能力可用凝聚值來表示，使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度（mmol/L）稱為凝聚值。根據(jù)Schuze-Hardy法則，陽離子的價數(shù)越高，該值就越小，即凝聚能力越強。陽離子對帶負電荷的發(fā)酵液膠體粒子凝聚能力的次序為：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)

（2）絮凝作用

絮凝作用是利用帶有許多活性官能團的高分子線狀化合物吸附多個微粒的能力，通過架橋作用將許多微粒聚集在一起，形成粗大的松散絮團的過程。所利用的高分子化合物稱為絮凝劑。絮凝劑一般具有長鏈狀結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)絮凝作用關(guān)鍵在于其鏈節(jié)上的多個活性官能團，包括帶電荷的陰離子（如—COOH）或陽離子（如—NH2）基團以及不帶電荷的非離子型基團。它們通過靜電引力、范德華力或氫鍵作用，強烈地吸附在膠粒表面。第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)根據(jù)絮凝劑所帶電性的不同，分陰離子型、陽離子型和非離子型三類。對于帶有負電性的微粒，加入陽離子型絮凝劑，具有降低離子排斥電位和產(chǎn)生吸附架橋作用的雙重機制；而非離子型和陽離子型絮凝劑，主要通過分子間引力和氫鍵等作用產(chǎn)生吸附架橋。影響絮凝作用的主要因素有：①高分子絮凝劑的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)線性結(jié)構(gòu)的有機高分子絮凝劑，其絮凝作用大，而成環(huán)狀或支鏈結(jié)構(gòu)的有機高分子絮凝劑的效果較差。絮凝劑的分子量越大、線性分子鏈越長，絮凝效果越好；但分子量增大，絮凝劑在水中的溶解度降低，因此要選擇適宜分子量的絮凝劑。

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②絮凝操作溫度當(dāng)溫度升高時，絮凝速度加快，形成的絮凝顆粒細小。因此絮凝操作溫度要合適，一般為20℃～30℃。③pH溶液pH的變化會影響離子型絮凝劑功能團的電離度，因此陽離子型絮凝劑適合在酸性或中性的pH環(huán)境中使用，陰離子型絮凝劑適合在中性或堿性的環(huán)境中使用。④攪拌速度和時間適當(dāng)?shù)臄嚢杷俣群蜁r間對絮凝是有利的，一般情況下，攪拌速度為(40～80)r/min，不要超過100r/min；攪拌時間以(2～4)min為宜，不超過5min。第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)⑤絮凝劑的加入量

絮凝劑的最適添加量往往要通過實驗方法確定，雖然較多的絮凝劑有助于增加橋架的數(shù)量，但過多的添加反而會引起吸附飽和，絮凝劑爭奪膠粒而使絮凝團的粒徑變小，絮凝效果下降。凝聚和絮凝這兩種作用是人們在研究作用機理時，為了方便描述而分別提出并進行討論，但在實際應(yīng)用中，絮凝劑與無機電解質(zhì)凝聚劑經(jīng)常搭配在一起使用，加入無機電解質(zhì)使懸浮粒子間的排斥能力降低而凝聚成微粒，然后加入絮凝劑，兩者相輔相成，二者結(jié)合的方法稱為混凝?；炷捎行岣吣酆托跄Ч?。

第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)工業(yè)上使用的絮凝劑按組成不同又可分為無機絮凝劑、有機絮凝劑和生物絮凝劑。①有機高分子絮凝劑

如人工合成的絮凝劑：二甲基二烯丙基氯化銨與丙烯酰胺的共聚物或均聚物、聚二烯基咪唑啉、聚丙烯酸類衍生物、聚苯乙烯類衍生物、聚丙烯胺類衍生物等。其中聚丙烯酰胺具有一定毒性，不能用于藥品、食品生產(chǎn)；而聚丙烯酸類衍生物陰離子型絮凝劑，無毒，可用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。天然有機高分子絮凝劑：聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖等。②無機高分子聚合物

如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等。第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)

③生物絮凝劑生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生的具有絮凝能力的生物大分子，主要有蛋白質(zhì)、粘多糖、纖維素和核酸等。具有高效、無毒、無二次污染等特點，克服了無機絮凝劑和人工合成有機高分子絮凝劑本身固有的缺陷，其發(fā)展?jié)摿υ絹碓绞艿街匾暋?．加入助濾劑加入助濾劑可以改變?yōu)V餅的結(jié)構(gòu)，降低濾餅的可壓縮性，從而降低過濾阻力。常用的助濾劑有硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖、白土、炭粒、淀粉等。最常用的是硅藻土。

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助濾劑的使用方法有兩種：一種是將助濾劑在支持介質(zhì)（濾布）的表面上預(yù)涂助濾劑薄層1～2mm，以保護支持介質(zhì)的毛細孔道在較長時間內(nèi)不被懸浮液中的固體粒子所堵塞，從而提高或穩(wěn)定過濾速度。另一種方法是將助濾劑分散在待過濾的懸浮液中，使形成的濾餅具有多孔性，降低濾餅的可壓縮性，以提高過濾速度和延長過濾操作周期。前者會使濾速降低，但濾液透明度明顯增加；后一種方法主要是助濾劑的加入量，一般助濾劑的用量若等于懸浮液中固體含量時，過濾速度最快，另外在使用時需要一個帶攪拌器的混合槽，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?，防止分層沉淀。生產(chǎn)上也可兩種方法同時兼用。選擇和使用助濾劑時要考慮以下幾個方面：第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)

①根據(jù)目的產(chǎn)物的性質(zhì)選擇助濾劑品種當(dāng)目的產(chǎn)物存在于液相時．要注意目的產(chǎn)物是否會被助濾劑吸附，是否可通過改變pH來減少吸附；當(dāng)目的產(chǎn)物存在于固相時，一般使用淀粉、纖維素等不影響產(chǎn)品質(zhì)量的助濾劑。

②根據(jù)過濾介質(zhì)和過濾情況選擇助濾劑品種當(dāng)使用粗目濾網(wǎng)時易泄漏，采用石棉粉、纖維素、淀粉等作助濾劑可有效地防止泄漏。當(dāng)使用細目濾布時，宜采用細硅藻土，若采用粗粒硅藻土，則料液中的細微顆粒仍將透過助濾層而到達濾布表面，從而使過濾阻力增大。當(dāng)使用燒結(jié)或粘結(jié)材料制成的過濾介質(zhì)時，宜使用纖維素助濾劑，這樣可使濾餅易于剝離，并可防止堵塞毛細孔。第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)

③粒度選擇助濾劑的粒度及粒度分布對過濾速率和濾液澄清度影響很大。當(dāng)粒度一定時，過濾速率與澄清度成反比，過濾速率大，澄清度差；過濾速率小，則澄清度好。助濾劑的粒度必須與懸浮液中固體粒子的尺寸相適應(yīng)，如顆粒較小的懸浮液應(yīng)采用較細的助濾劑。商品硅藻土助濾劑有多種規(guī)格，粒度分布不同，因此使用前應(yīng)針對不同料液的特性和過濾要求，通過實驗，確定其最佳型號。

④用量的確定助濾劑的用量必須適宜。用量過少，起不到有效的助濾作用；用量過大，不僅浪費，而且會因助濾劑成為主要的濾餅阻力而使過濾速率下降。第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)

當(dāng)采用預(yù)涂助濾劑的方法時，間歇操作助濾劑的最小厚度為2mm；連續(xù)操作則要根據(jù)所需過濾速率來確定。當(dāng)助濾劑直接加入發(fā)酵液時，一般采用的助濾劑用量等于懸浮液中固形物含量，其過濾速率最快，如用硅藻土作助濾劑時，通常細粒用量為500g／m3；中等粒度用量為700g／m3；粗粒用量為(700～1000)g／m3。

第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)5．加入反應(yīng)劑

有時加入某些不影響目的產(chǎn)物的反應(yīng)劑，可消除發(fā)酵液中某些雜質(zhì)對過濾的影響，從而提高過濾速率。加入反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，如CaSO4、AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，并且能使膠狀物和懸浮物凝固，從而改善過濾性能。如在新生霉素發(fā)酵液中加入氯化鈣和磷酸鈉，生成磷酸鈣沉淀可充當(dāng)助濾劑，另一方面可使某些蛋白質(zhì)凝固。又如環(huán)絲氨酸發(fā)酵液用氧化鈣和磷酸處理，生成磷酸鈣沉淀，能使懸浮物凝固，多余的磷酸根離子還能除去鈣、鎂離子，并且在發(fā)酵液中不會引入其它陽離子，以免影響環(huán)絲氨酸的離子交換吸附。第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)

二、發(fā)酵液的相對純化

1.

無機離子的去除發(fā)酵液中主要的無機離子有Ca2+、Mg2+、Fe2+等。Ca2+的去除主要采用草酸，但由于草酸的溶解度小，不適合用量較大的場合。當(dāng)發(fā)酵液中Ca2+離子濃度較高時，可采用可溶性鹽，如草酸鈉等。反應(yīng)生成草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固，改善發(fā)酵液過濾性能。Mg2+離子的去除一般采用加入三聚磷酸鈉，它和Mg2+形成可溶性絡(luò)合物后，即可消除對離子交換的影響。Mg2++Na5P3O10====MgNa3P3O10+2Na+第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)

用磷酸鹽處理，也能大大降低Ca2+

、Mg2+離子的濃度，此法可用于環(huán)絲氨酸的生產(chǎn)。對于發(fā)酵液中的鐵離子，可加入黃血鹽，使其形成普魯士藍沉淀而除去。反應(yīng)如下：3K4Fe(CN)6+4Fe3+====Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+

2．雜蛋白的去除利用各種沉淀方法，可以去除液相中各種蛋白質(zhì)。常用的有等電點沉淀法、變性沉淀法、鹽析法、有機溶劑沉淀法、反應(yīng)沉淀法等。這些沉淀方法既可以作為除雜質(zhì)的方法，也可以作為提取目標(biāo)產(chǎn)物的技術(shù)手段。有關(guān)沉淀法除蛋白質(zhì)詳見第三章沉淀技術(shù)。

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3．多糖的去除酶解法可將混合液中的不溶性多糖物質(zhì)酶解，使其轉(zhuǎn)化為溶解度較大的單糖，從而改變流體的流動特性，提高過濾速率。例如萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵完成后，發(fā)酵液中多余的淀粉使混合液粘度較大，當(dāng)加入0.025％的淀粉酶后，攪拌30min，再加2.5％助濾劑（硅藻土），可使過濾速率提高5倍。

第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)

4．有色物質(zhì)的去除

發(fā)酵液中有色物質(zhì)可能是由于微生物生長代謝過程分泌的，也可能是培養(yǎng)基（如糖蜜、玉米漿等）帶來的，色素物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的多樣性增加了脫色的難度。色素物質(zhì)的去除，一般以使用離子交換樹脂、離子交換纖維、活性炭等材料的吸附法來脫色最為普遍。例如活性炭可用于檸檬酸發(fā)酵液的脫色，鹽型強堿性陰離子交換樹脂可用于果膠酶溶液的脫色，磷酸型陰離子交換樹脂被用于谷氨酸發(fā)酵液的脫色等。一般發(fā)酵液的脫色往往是在過濾除去菌體后進行。第二節(jié)固液分離

生化產(chǎn)品通常利用機械方法進行固液分離。按其所涉及的流動方式和作用力的不同，可分為過濾、沉降和離心分離。過濾是以某種多孔性物質(zhì)作為介質(zhì)，在外力的作用下，懸浮液中的流體通過介質(zhì)孔道，而固體顆粒被截留下來，從而實現(xiàn)固液分離的過程。

沉降是依靠外力的作用，利用分散物質(zhì)（固相）與分散介質(zhì)（液相）的密度差異，使之發(fā)生相對運動，而實現(xiàn)固液分離的過程。離心分離是利用裝置所提供的慣性離心力的作用來實現(xiàn)固液分離的過程。第二節(jié)固液分離

不同性狀的發(fā)酵液應(yīng)選擇不同的固液分離方法和設(shè)備，如霉菌和放線菌為絲狀菌，體形較大，其發(fā)酵液大多采用過濾方法處理；而細菌和酵母菌為單細胞，體形較小，外形尺寸大多在1～10μm范圍，其發(fā)酵液一般采用高速離心機分離。但若對其發(fā)酵液采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行預(yù)處理，則細菌和酵母菌發(fā)酵液也可采用過濾方法進行固液分離。如生產(chǎn)菌菌體較小的氨基酸發(fā)酵液，采用絮凝和添加助濾劑等方法進行預(yù)處理后可用板框過濾機或帶式過濾機進行菌體分離。第二節(jié)固液分離

一、發(fā)酵液的過濾實現(xiàn)過濾操作的外力是過濾介質(zhì)兩側(cè)的壓力差，壓差可以通過重力、加壓、抽真空來獲得。依據(jù)過濾介質(zhì)所起主要作用不同可分為：餅層過濾或深床過濾。依據(jù)提供外力的方式不同又可分為常壓過濾、真空抽濾。依據(jù)過濾時外加壓力和流速的不同，可分為：①恒壓過濾，用壓縮空氣或真空作為推動力；②恒速過濾，通常用定容泵來輸送料液；③變速-變壓過濾操作方式，用離心泵來實現(xiàn)。在生化產(chǎn)品的生產(chǎn)中，真空抽濾應(yīng)用較多。第二節(jié)固液分離

在深床過濾中，過濾介質(zhì)起主要過濾作用。所用介質(zhì)為硅藻土、砂、顆?；钚蕴?、玻璃珠、塑料顆粒、燒結(jié)陶瓷、燒結(jié)金屬等，填充于過濾器內(nèi)構(gòu)成過濾層。當(dāng)懸浮液通過過濾層時，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層顆粒上，使濾液得以澄清。這種方法適合于固體含量少于0.001g/mL，顆粒直徑在(5～100)μm的懸浮液的過濾分離，如河水、麥芽汁、酒類和飲料的過濾澄清。第二節(jié)固液分離

在餅層過濾中，沉積于過濾介質(zhì)上的餅層起主要過濾作用。過濾介質(zhì)為濾布，包括天然或合成纖維織布、金屬織布、石棉板、玻璃纖維紙等。當(dāng)懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布所阻攔而逐漸形成濾餅，濾餅至一定厚度時即起過濾作用，此時濾布主要起支撐作用。這種方法常用于分離固體含量大于0.001g/mL的懸浮液。一個完整的餅層過濾過程主要包括三個步驟：①濾餅的形成；②濾餅的洗滌；③濾餅的清除。濾餅的形成是從被處理的料液接觸過濾介質(zhì)時開始的，隨著過濾時間的增長，餅層厚度逐漸增大；濾餅的洗滌是回收餅層中的有用物質(zhì)或者是除去餅層中的雜質(zhì)，洗滌液的體積與流速決定著回收率的高低及洗滌時間的長短；濾餅的清除主要是在過濾一定時間后，過濾阻力增大，濾速明顯減小時，將餅層從過濾介質(zhì)上除去，以便使過濾能夠在較高過濾速度下進行。

第二節(jié)固液分離

1.發(fā)酵液的過濾特性和濾餅的比阻微生物發(fā)酵液多屬于非牛頓型流體，濾渣為可壓縮性的。衡量過濾特性的主要指標(biāo)是濾餅的質(zhì)量比阻rB，它表示的是單位濾餅厚度的阻力系數(shù)，與濾餅的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。對于不可壓縮濾餅，比阻值是常數(shù)。對于可壓縮濾餅，比阻是操作壓力的函數(shù)，可用下式表示（1-1）

式中r——不可壓縮濾餅的比阻，對一定的料液其值為常數(shù)；m——壓縮指數(shù)，一般取0.5～0.8，對于不可壓縮性濾餅為0；△P——壓力差，Pa。第二節(jié)固液分離

發(fā)酵液濾餅的比阻與一般可壓縮濾餅相比，有其特殊性。一般可壓縮濾餅的比阻是操作壓力的函數(shù)，在不變的壓差之下，濾餅比阻是一定值，即在不變壓力差下過濾時，過濾速度的逐漸下降是由于濾餅厚度的逐漸增加所致，而作為單位濾餅厚度的過濾阻力即濾餅的比阻是不變的。但對于發(fā)酵液濾餅，即使在恒定的操作壓差下，當(dāng)濾餅中所含固形物濃度達到某一界限值時，濾餅的比阻就不是一定值，而會突然升高。因此過濾速度不但隨濾餅厚度的增加而下降，還會因濾餅比阻的突然升高而額外下降。這可能是由于有機物質(zhì)的膠體粒子借靜電吸引而結(jié)合的水分子所致。對發(fā)酵液進行預(yù)處理，也可以降低結(jié)合水的百分率，提高自由水的百分率，使發(fā)酵液濾餅更接近一般可壓縮濾餅的性質(zhì)。第二節(jié)固液分離

2．影響過濾性能的因素影響過濾性能的因素很多，主要有：（1）混合物中懸浮微粒的性質(zhì)和大小

一般情況下，懸浮微粒越大，粒子越堅硬，大小越均勻，固液分離越容易，過濾速度越大。如發(fā)酵液中的細菌菌體較小，分離較困難，過濾速度就會相對減??；而膠體粒子通常懸浮于流體中，必須運用凝聚與絮凝技術(shù)，增大懸浮粒子的體積，以利于固液分離，從而獲得澄清的濾液。第二節(jié)固液分離

（2）混合液的粘度流體的流動特性對固液分離影響很大，其中流體的粘度越大，固液分離越困難，過濾速度就會降低。通?；旌弦旱恼扯扰c其組成和濃度密切相關(guān)，組成越復(fù)雜，濃度越高，其粘度越大。在微生物發(fā)酵制藥生產(chǎn)中，菌體種類和濃度不同，其粘度差別很大。另外，培養(yǎng)基中若用淀粉作碳源，黃豆餅作氮源，其發(fā)酵液的粘度也較大。若發(fā)酵終點控制不當(dāng)，菌體發(fā)生自溶，也會使發(fā)酵液變粘。第二節(jié)固液分離

（3）操作條件固液分離操作中溫度、pH、操作壓力、濾餅厚度等的控制也會影響固液分離速率。溫度升高，流體粘度降低；調(diào)整pH，也可改變流體粘度，從而使固液分離效率得到提高。提高操作壓力一般可提高過濾速度，但如果濾餅的可壓縮性較大時，提高壓力往往會使濾餅進一步壓縮，過濾阻力增大，反而使濾速下降。降低濾餅層的厚度會減小過濾阻力，提高濾速。第二節(jié)固液分離

（4）助濾劑的使用

當(dāng)固體顆粒易受壓變形時，采用一般過濾分離很困難，常采用加助濾劑的方式，以順利完成過濾分離操作。助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。助濾劑使用可使懸浮液中大量的細微膠體粒子被吸附到助濾劑的表面上，從而使濾餅的可壓縮性下降，過濾阻力降低。助濾劑的選擇以不吸附或少吸附目標(biāo)產(chǎn)品為準(zhǔn)。（5）固液分離設(shè)備和技術(shù)采用不同的固液分離技術(shù)，如過濾、沉降和離心分離，其分離效果不同；同一種分離技術(shù)，選用的設(shè)備結(jié)構(gòu)、型號不同，其分離效果也不同。在選擇固液分離設(shè)備時，要根據(jù)被分離混合物的性質(zhì)、分離要求、操作條件等因素綜合考慮。第二節(jié)固液分離

3．改善過濾性能的方法在生產(chǎn)中常會遇到難以過濾的發(fā)酵液，因此需要通過改善過濾性能，降低濾餅比阻的方法來提高過濾速率，工藝上一般采用降低混合液粘度的方法、增大被分離顆粒的粒度或者在混合液中加入助濾劑的方法、提高離心機的轉(zhuǎn)速或提高操作壓力、增大真空度、降低濾餅層的厚度，或除去濾餅等方法以改善過濾性能。

4．過濾設(shè)備工業(yè)上較為常用的過濾設(shè)備有板框過濾機、真空轉(zhuǎn)鼓過濾機。第二節(jié)固液分離

板框過濾機主要用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細菌等多種發(fā)酵液的固液分離，比較適合固體含量1%～10%的懸浮液的分離。板框過濾機過濾面積大，過濾推動力能大幅度調(diào)整，能耐受較高的壓力差，固相含水分低，能適應(yīng)不同過濾特性的發(fā)酵液的過濾。自動板框過濾機，由于使板框的拆裝、濾餅卸出和濾布的清洗等操作都能自動進行，正逐漸替代傳統(tǒng)手工操作板框過濾機。

真空轉(zhuǎn)鼓過濾機特別適合于固體含量較大（>10%）的懸浮液的分離，由于受推動力(真空度)的限制，真空轉(zhuǎn)鼓過濾機一般不適合于菌體較小和粘度較大的細菌發(fā)酵液的過濾，而且采用真空轉(zhuǎn)鼓過濾機過濾所得固相的干度不如加壓過濾。目前，在標(biāo)準(zhǔn)型轉(zhuǎn)鼓真空過濾機的基礎(chǔ)上，又開發(fā)出一些新設(shè)備，如無格式轉(zhuǎn)鼓真空過濾機、濾布循環(huán)行進式（RCF）轉(zhuǎn)鼓真空過濾機等。新機型的特點是結(jié)構(gòu)簡單、單位面積過濾能力大、洗滌能力強、效率高。第二節(jié)固液分離

二、離心分離離心分離是基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程。離心分離在生物產(chǎn)品分離中應(yīng)用十分廣泛，與其它固液分離方法相比，離心分離具有分離速率快、分離效率高、液相澄清度好等優(yōu)點。缺點是設(shè)備投資高、能耗大，此外連續(xù)排料時固相干度不如過濾設(shè)備。按作用原理不同，離心分離可分為離心沉降和離心過濾兩種方式。第二節(jié)固液分離

1．離心沉降離心沉降在實現(xiàn)固液分離時，不需要過濾介質(zhì)，離心機的轉(zhuǎn)鼓上不開設(shè)小孔，在離心力的作用下，物料按密度的大小不同分層沉降而得以分離，可用于液-固、液-液、液-液-固物料的分離。工業(yè)上較為常用離心沉降設(shè)備有管式離心機和碟片式離心機。管式離心機的分離因數(shù)高達104-（6×105），除可用于微生物細胞的分離外，還可用于細胞碎片、細胞器、病毒、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離。但由于管式離心機的轉(zhuǎn)鼓直徑較小，容量有限，因而生產(chǎn)能力較小。管式離心機可用于固-液、液-液分離，用于液-液分離時為連續(xù)操作，用于固液分離時則為間歇操作。一般適合于分離固形物含量＜1%的發(fā)酵液的分離。管式離心機碟片式離心機的分離因數(shù)為1000～20000，適應(yīng)于含細菌、酵母菌、放線菌等多種微生物細胞的懸浮液及細胞碎片懸浮液的分離。它的生產(chǎn)能力較大，最大允許處理量達300m3/h，一般用于大規(guī)模的分離過程。第二節(jié)固液分離

2.

離心過濾離心過濾在實現(xiàn)固液分離時，需要過濾介質(zhì)，離心機的轉(zhuǎn)鼓上開有小孔，在離心力的作用下，液體穿過過濾介質(zhì)經(jīng)轉(zhuǎn)鼓上的小孔流出，固體則吸附在濾布上形成濾餅層，從而實現(xiàn)固液的分離。以后液體要依次流經(jīng)餅層、濾布再經(jīng)小孔排出，濾餅層隨過濾時間的延長而逐漸加厚，至一定厚度后停止過濾，進行卸料處理后再轉(zhuǎn)入過濾操作。第二節(jié)固液分離

三、其它固液分離方法1.切向流過濾在一般過濾中，濾液的流動方向與濾餅基本垂直，稱為封頭過濾（Dead-EndFiltration）。當(dāng)采用這種方式來分離細菌、細胞碎片、蛋白質(zhì)等懸殊浮液時，由于其固體顆粒細微，可壓縮性大，所形成的濾餅阻力大，隨著過濾的進行，過濾速度迅速下降。

第二節(jié)固液分離

切向流過濾（Cross-FlowFiltration）又稱錯流過濾、交叉過濾或十字流過濾，是一種維持恒壓下高速過濾的技術(shù)。其操作特點是使懸浮液在過濾介質(zhì)表面作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走。當(dāng)移走固體的速率與固體的沉積速率相等時，過濾速率就近似恒定。較為常用的實現(xiàn)切向流過濾的方法有：用泵循環(huán)使懸浮液流經(jīng)過濾介質(zhì)或在介質(zhì)表面加以攪拌造成流動，產(chǎn)生切向流。第二節(jié)固液分離

2.雙水相萃取雙水相萃取是向水相中加入溶于水的某種高分子化合物（如聚乙二醇、葡聚糖）后，形成密度不同的兩相，輕相中富含某種高分子化合物，重相中富含鹽類或另一種高分子化合物，從而達到分離某種高分子化合物的目的?？捎糜诜蛛x細胞碎片和蛋白質(zhì)等。有關(guān)雙水相萃取詳見第二章萃取和浸取技術(shù)。

第二節(jié)固液分離

固液分離設(shè)備類型很多，性能差異很大，選擇時要考慮多方面的因素。首先要根據(jù)混合物的性質(zhì)和分離要求，考慮選用過濾還是沉降，是否選用慣性離心力作為推動力。若固液分離要求較完全，則選用過濾操作；若固液密度差較大，可考慮選用沉降，否則宜選用過濾；若固體顆粒較小，流體粘度較大，則需選用離心分離；對于易揮發(fā)或易燃燒的流體，一般不宜選用真空過濾；而對于有毒的混合液，則一般選用密閉操作的固液分離設(shè)備。另外，還要根據(jù)工藝過程特點和生產(chǎn)規(guī)模進一步選擇確定設(shè)備類型。一般當(dāng)固體含量較高、生產(chǎn)規(guī)模較大時，宜選用連續(xù)式的、勞動強度小的設(shè)備；如果生產(chǎn)工藝本身就是間歇式的，則選用間歇設(shè)備可以節(jié)省設(shè)備費用和操作費用。

第二節(jié)固液分離

四、預(yù)處理及固液分離技術(shù)應(yīng)用實例以鏈霉素發(fā)酵液的預(yù)處理及固液分離技術(shù)為例，其工藝過程如下：第二節(jié)固液分離

由于鏈霉素在發(fā)酵終了時，部分鏈霉素留在菌絲內(nèi)部，為了使其釋放至液體中，將發(fā)酵液酸化至pH3左右，以提高鏈霉素的收率。同時以直接蒸汽加熱，可使蛋白質(zhì)凝固，提高過濾速度。根據(jù)在稀溶液中優(yōu)先吸附高價離子的原則，需將發(fā)酵液進行稀釋（一般用回流水或三次水來稀釋），一般稀釋到6000單位/毫升左右，若采用反吸附，則不需過濾，可將發(fā)酵液直接以水稀釋到3000單位/毫升左右。第二節(jié)固液分離

由于鏈霉素的進一步提取采用的是離子交換法，而發(fā)酵原液中除蛋白質(zhì)外，尚含有鈣、鎂等金屬離子，對離子交換吸附有影響，因此必須在預(yù)處理時除去這些金屬離子。例如酸化用的草酸還能將Ca2+去除，再用磷酸除去Mg2+，即在發(fā)酵液中加入磷酸，在酸性時凝聚部分蛋白質(zhì)過濾分離后，再加入堿調(diào)pH=8.8～9.0，借磷酸根的作用使鈣、鎂等離子生成不溶性的磷酸鹽而析出，并隨同堿性蛋白質(zhì)一起被過濾去除。經(jīng)過上述酸化、加熱、分離、冷卻、中和等處理，能將發(fā)酵液中的大量菌絲體、蛋白質(zhì)和堿土金屬等雜質(zhì)去除，可保證下一步離子交換過程的順利進行。第三節(jié)細胞壁的破碎

細胞壁是微生物菌體比較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。不僅取決于微生物的類型，還取決于培養(yǎng)發(fā)酵液的組成、細胞所處的生長階段、細胞的存儲方式以及其它一些因素。不同微生物菌體細胞壁的結(jié)構(gòu)有一定差異。一、細菌細菌的細胞壁堅韌而有彈性，由不同的肽鏈結(jié)合組成質(zhì)量均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其厚度因細菌不同而有差異，可抵御外界的機械損傷，并可承受細胞內(nèi)強大的滲透壓而不被破壞。

第三節(jié)細胞壁的破碎

圖2-1細菌細胞壁的主要組分

第三節(jié)細胞壁的破碎

細胞壁的主要成份是肽聚糖，由N—乙酰葡糖胺（見圖2-1a）和N—乙酰胞壁酸（見圖2-1b）構(gòu)成雙糖單元，以β（1-4）糖苷鍵連接成大分子。N—乙酰胞壁酸分子上四肽側(cè)鏈，相鄰葡聚糖纖維之間的短肽通過肽橋或肽鍵連接起來，組成機械性很強的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，像膠合板一樣，粘合成多層。各種細菌細胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)均相同，但在四肽側(cè)鏈的組成及其連接方式上隨菌種不同而有差異。革蘭氏陽性菌細胞壁（見圖2-2）較厚，約20～80nm。含15～50層肽聚糖片層，每層厚度1nm，約占細胞干重的50%～80%。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。第三節(jié)細胞壁的破碎

革蘭氏陰性菌細胞壁（見圖2-3）細胞壁較薄，有1～2層肽聚糖片，在肽聚糖層外尚有脂蛋白、脂質(zhì)雙層、脂多糖三部分。脂蛋白的功能是將外膜固定于肽聚糖層，脂類和蛋白質(zhì)等在穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)上非常重要，如果被抽提，細胞壁將變得很不牢固。第三節(jié)細胞壁的破碎二、真菌和酵母真菌的細胞壁含有幾丁質(zhì)（N-乙酰葡萄糖胺的一種聚合物）、纖維素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。此外還有蛋白質(zhì)、類脂、無機鹽等。而酵母的細胞壁（見圖2-4）由特殊的纖絲狀物質(zhì)構(gòu)成，主要成份是甘露聚糖（31%），葡聚糖（29%），蛋白質(zhì)（13%）和類脂質(zhì)（8.5%）。酵母中的葡聚糖的為

β-1，6-葡聚糖通過β-1，3鍵與D-葡萄糖中第一側(cè)鏈交連而不溶于水。所有的真菌細胞壁是由不同的多糖鏈相互纏繞成一股又粗又壯的鏈，嵌入在蛋白質(zhì)及類脂和一些小分子的多糖基質(zhì)中，看起來像鋼筋混凝土，從而解釋了真菌細胞壁的機械強度和硬度。第三節(jié)細胞壁的破碎

三、藻類藻類的細胞壁更為復(fù)雜，其主要結(jié)構(gòu)成份，是纖絲狀的多糖類物質(zhì)。

M-甘露聚糠；P-磷酸二脂鍵；G-葡聚糠圖2-4酵母細胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖

第三節(jié)細胞壁的破碎

細胞破碎的方法很多，在諸多破碎方法中，機械法中的球磨機和高壓勻漿機不僅在實驗室而且在工業(yè)上得到應(yīng)用。其它的方法大多尚停留在實驗室應(yīng)用，工業(yè)化的應(yīng)用還在探索之中。

一、球磨法球磨機是破碎微生物細胞的常用設(shè)備，一般有立式（見圖2-5）或臥式（見圖2-6）兩種，在磨腔中裝入小玻璃球或小鋼球，由電動機帶動攪拌碟片高速攪拌微生物細胞懸浮物和小磨球而產(chǎn)生剪切力，將細胞破碎。第三節(jié)細胞壁的破碎圖2-5NetzschMolinexKE5攪拌磨

圖2-6NetzshLM20砂磨機一般用破碎率Y表示破碎程度。破碎率定義為被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞的百分?jǐn)?shù)。式中N0——原始細胞數(shù)量；N——經(jīng)t時刻操作后保留下來的未受損害完整細胞的數(shù)量。N0和N可由直接計數(shù)法和間接法求得。第三節(jié)細胞壁的破碎直接計數(shù)法是直接對稀釋后的樣品用血球計數(shù)器或平板菌落計數(shù)法進行計數(shù)。間接計數(shù)法是在細胞破碎后，將懸浮液離心分離，除去細胞碎片，未破碎的細胞及其他懸浮物，然后對清液進行蛋白質(zhì)含量或酶的活性進行分析。通過細胞釋放出來的化合物的量R與所有細胞理論最大釋放量Rm的比值R/Rm，求出破碎率。第三節(jié)細胞壁的破碎

破碎率是選擇細胞破碎設(shè)備的重要依據(jù)之一。在用球磨法破碎細胞的過程中，影響因素有以下幾個方面：（1）攪拌器外緣速率

攪拌器速度增加，剪切力增大，細胞破碎量增大，但是高的能量消耗，高的熱量產(chǎn)生和磨球的磨損以及因剪切力引起產(chǎn)物失活，因此對于給定處理量和對蛋白質(zhì)的釋放要求下，存在著最佳效率點。實際生產(chǎn)中，攪拌器外緣速率控制在（5～15）m/s之間。第三節(jié)細胞壁的破碎

（2）細胞的濃度

在細胞破碎過程中，產(chǎn)生的熱量隨濃度的增大而提高，增加了冷卻的費用。因此最佳的細胞濃度由實驗來確定。用NetzshLM20研磨和破碎酵母或細菌時，細胞濃度控制在40%左右。（3）球粒大小和裝填量

磨球越小，細胞破碎速度越快。但磨球太小而漂浮，難以停留在磨腔中。因此實驗室規(guī)模的研磨機中，球徑為0.2mm較好；而工業(yè)化規(guī)模操作中，球徑>0.4mm。且不同的細胞，應(yīng)選擇不同的球徑。球粒的體積占研磨機腔體自由體積的百分比同樣影響破碎效果，一般控制在80%～90%之間，并隨球粒直徑大小而變化。

第三節(jié)細胞壁的破碎

（4）溫度操作溫度控制在5℃～40℃范圍內(nèi)對破碎物影響不大。但在研磨過程中會產(chǎn)生熱量積累，為控制磨室溫度，在攪拌器和磨室外筒分別設(shè)計有冷卻夾套，通過冷卻劑來調(diào)節(jié)磨室的溫度。（5）流量高流量有利于降低能耗、降低細胞的破碎程度和釋放蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。（6）微生物特性一般來說酵母比細菌細胞處理效果好。因為細菌細胞僅為酵母細胞的十分之一，而且細菌細胞的機械強度比酵母要高。一臺20L球磨機在最適條件下，每小時可加工200kg面包酵母，而在同樣條件下，處理細菌細胞僅為10～20kg。第三節(jié)細胞壁的破碎二、高壓勻漿法高壓勻漿法是液體剪切破碎方法中的一種。它的主要設(shè)備是高壓勻漿機，它有一個高壓位移泵和一個可調(diào)節(jié)進料速度的針形閥（見圖2-7）。當(dāng)菌體懸浮液經(jīng)過高壓泵加壓后，通過閥芯與閥座之間的通道時，懸浮液突然改變方向，向球撞擊。在通過閥門時產(chǎn)生高剪應(yīng)力，向環(huán)撞擊時產(chǎn)生巨大的沖擊力，將細胞破碎，然后排出。圖2-7高壓勻漿機的排出閥裝置圖

第三節(jié)細胞壁的破碎

在高壓勻漿機操作中，主要影響因素有：（1）溫度

破碎率隨著溫度的升高而增加。但是高溫破碎只適用于非熱變性產(chǎn)物，如果溫度高于40℃時，蛋白質(zhì)在破碎過程中會發(fā)生變性。因此，進口處用干冰來調(diào)節(jié)溫度，使出口處的溫度維持在20℃左右。

（2）壓力操作壓力的合理選擇非常重要。提高壓力需增加消耗，壓力每升高100Mpa會多消耗3.5KW能量；壓力每升高10Mpa，溫度將提高2℃；另外壓力過高將引起高壓勻漿機排出閥座劇烈磨損。通常，對于非結(jié)合的酶，操作壓力為5.45×107Pa，菌體濃度10%～20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），處理一次即可。一般來講，高壓勻漿機最適合于酵母和細菌。

第三節(jié)細胞壁的破碎三、超聲破碎法

超聲破碎法是另一種液相剪切破碎法。其實驗室裝置見圖2-8。

圖2-8連續(xù)破碎池的結(jié)構(gòu)簡圖

第三節(jié)細胞壁的破碎

通過超聲探頭向懸浮液輸入聲能，大量聲能轉(zhuǎn)化成彈性波形式的機械能，引起局部的剪切梯度，使細胞破碎。同時，絕大部分釋放出的能量都以熱的形式被液體吸收，為避免高溫，在破碎池中設(shè)計了冷卻水夾套，并在開始時先把懸浮液冷卻至0℃～5℃，并不斷將冷卻液連續(xù)通過夾套，短期的聲波破碎與短期的冷卻交替進行操作，以防止高溫使蛋白質(zhì)變性。為提高破碎效率，在破碎池中可添加細小的球粒（可以是鋼制的或玻璃的），以產(chǎn)生“研磨”效應(yīng)，提高細胞破碎率。超聲波破碎是實驗室常用的一種普通方法，由于向大量的懸浮液中輸入足夠的能量有一定的困難，因此在工業(yè)還未采用。第三節(jié)細胞壁的破碎四、酶溶法

酶溶法是利用細胞壁水解酶使細胞壁溶解，釋放出胞內(nèi)物質(zhì)的方法。根據(jù)菌體不同的細胞壁結(jié)構(gòu)選用特定的溶解酶。常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等等。溶菌酶主要用于細菌類，其它酶對酵母作用較顯著。溶酶具有高度專一性，蛋白酶只能水解蛋白質(zhì)，葡聚糖酶只對葡聚糖起作用，因此利用溶酶系統(tǒng)處理細胞時，必須根據(jù)細胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的順序。第三節(jié)細胞壁的破碎

酵母細胞壁溶解酶主要成份是β-1,3-葡聚糖酶，當(dāng)它與磷酸甘露聚糖酶、蛋白酶同時作用時，對溶解酵母的作用顯著增強。而β-1,3-葡聚糖酶與幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用時可溶解由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成的霉菌細胞壁。酶溶法的優(yōu)點有：①對設(shè)備的要求低，能耗??；②抽提的速率和收率高；③產(chǎn)品的完整性好；④對pH值和溫度等外界條件要求低；⑤由于細胞壁被溶解，不殘留碎片，有利于提純。但是酶溶法受酶的費用限制。

第三節(jié)細胞壁的破碎五、化學(xué)滲透法

用某些化學(xué)試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分的方法稱為化學(xué)滲透法。例如在發(fā)酵液中添加脂溶性有機溶劑（甲苯、丁醇、丙酮、氯仿等）、金屬螯合劑、變性劑和表面活性劑等，改變細胞壁或膜的通透性，使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地釋放出來。有機溶劑被細胞壁吸收后，能夠分解細胞壁中的類脂，使細胞壁膨脹或溶解，導(dǎo)致破裂，把胞內(nèi)產(chǎn)物釋放到水相中去。變性劑，如鹽酸胍和脲，一般認(rèn)為與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。例如：鹽酸胍可以用大腸桿菌膜碎片中溶解蛋白。第三節(jié)細胞壁的破碎

表面活性劑分子中間同時具有憎水基團和親水基團，當(dāng)濃度達到一定時，它的分子會產(chǎn)生聚集生成膠束，憎水端向內(nèi)，親水端向外。憎水基團聚集在膠束內(nèi)部將溶解的脂蛋白包在中心，而親水基團則向外層，使膜的通透性改變或使細胞壁溶解，從而使胞內(nèi)物質(zhì)釋放到水相中。此法特別適用于膜結(jié)合蛋白酶的溶解。

EDTA金屬螯合劑，對革蘭氏陰性菌的細胞外層膜有破壞作用，因為其通?？库}離子或鎂離子結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持結(jié)構(gòu)。EDTA可將鈣離子或鎂離子螯合，導(dǎo)致大量的脂多糖分子脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴，這些區(qū)域由內(nèi)層的磷脂來填補，從而導(dǎo)致膜通透性的增強。第三節(jié)細胞壁的破碎六、其它方法除上述各種方法外，常用的方法還有以下幾種。（1）反復(fù)凍融法將待破碎細胞在—15℃至—20℃條件下冷凍，然后在室溫下融化，冷凍時膜的疏水鍵被破碎而疏水性增強，胞內(nèi)水形成冰晶粒而使細胞內(nèi)鹽分濃度加大，反復(fù)凍融多次，使細胞破裂將胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。此方法只適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，常需反復(fù)多次。此外，在凍融過程中可能會引起某些蛋白質(zhì)變性。

（2）干燥法將待破碎細胞用不同方法進行干燥，菌體細胞失水，細胞內(nèi)鹽分濃度增大，細胞滲透性發(fā)生變化，然后用丙酮，乙醇或緩沖溶液等溶劑抽提胞內(nèi)物質(zhì)。干燥的方法有空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥等。對不穩(wěn)定生化物質(zhì)進行干燥時，常加入半胱氨酸，巰基乙醇和亞硫酸鈉等還原劑進行保護?？諝飧稍铮饬鞲稍铮┲饕m用于酵母菌，真空干燥多用于細菌，冷凍干燥多用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)。第三節(jié)細胞壁的破碎

（3）滲透壓沖擊法將兩種不同成分或不同濃度的溶液，中間用半透膜隔開，則兩種溶液因性質(zhì)不同可由一方向另一方滲透，這種現(xiàn)象叫滲透現(xiàn)象，其推動力是滲透壓。菌體細胞膜是天然半透膜，把待破碎細胞經(jīng)一定濃度甘油或蔗糖溶液處理，在高滲壓溶液中細胞脫水，細胞質(zhì)變稠，發(fā)生質(zhì)壁分離。然后轉(zhuǎn)入低滲透壓溶液中或緩沖溶液中，細胞快速吸水膨脹而破裂，使胞內(nèi)物釋放到溶液中。用此法處理大腸桿菌時，可使磷酸脂酶、核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶等釋放至溶液中。蛋白質(zhì)釋放量一般為菌體蛋白總量的4%～7%。但此法對革蘭氏陽性菌不適用。第三節(jié)細胞壁的破碎

（4）冷熱交替法將待破碎細胞在90℃維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰水浴使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細胞可以被破碎。從細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此法。無論是運用機械法還是非機械法都要既能破壞微生物菌體的細胞壁，又要得到不發(fā)生變性的蛋白產(chǎn)物。因此，選擇合理的破碎方法非常重要，通常選擇破碎方法遵循以下一般原則：

①提取的產(chǎn)物在細胞質(zhì)內(nèi)，選用機械破碎法；②在細胞膜附近則可用溫和的非機械法；③提取的產(chǎn)物與細胞壁或膜相結(jié)合時，可采用機械法和化學(xué)法相結(jié)合的方法，以促進產(chǎn)物溶解度的提高或緩和操作條件；④為提高破碎率，可采用機械法和非機械法相結(jié)合的方法。如面包酵母的破碎，可先用細胞壁溶解酶予處理，然后用高壓勻漿機在95Mpa壓力下勻漿四次，總破碎率可接近100%，而單獨用高壓勻漿機破碎率只有32%。第四節(jié)包涵體外源基因在大腸桿菌中的高表達常常導(dǎo)致包涵體的形成。所謂包涵體是指蛋白質(zhì)分子本身及與其周圍的雜蛋白、核酸等形成不溶性的，無活性的聚集體，其中大部分是克隆表達的目標(biāo)產(chǎn)物蛋白。這些目標(biāo)產(chǎn)物蛋白在一級結(jié)構(gòu)上是正確的，但在立體結(jié)構(gòu)上卻是錯誤的，因此沒有生物活性。在利用大腸桿菌生產(chǎn)蛋白的過程中，重組蛋白大多數(shù)情況是以包涵體形式存在。要從包涵體中分離出具有生物活性的產(chǎn)物，通常的處理步驟為：收集菌體細胞→細胞破碎→離心分離→包涵體的洗滌→目標(biāo)蛋白的變性溶解→目標(biāo)蛋白的復(fù)性。第四節(jié)包涵體一、包涵體的形成、分離及洗滌

形成包涵體的因素主要有以下幾個方面：①重組蛋白的表達率過高，超過了細菌的正常代謝，由于細菌的蛋白水解能力達到飽和，導(dǎo)致重組蛋白在細胞內(nèi)沉淀下來；②由于合成速度太快，以致沒有足夠時間進行肽鏈折疊，二硫鍵不能正確配對，導(dǎo)致重組蛋白溶解度變??；③與重組蛋白的氨基酸組成有關(guān)，一般說含硫氨基酸越高越易形成包涵體，脯氨酸的含量明