實驗四醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白課件

實驗四血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳目的

1、掌握電泳的基本原理

2、掌握電泳的基本操作原理電泳:帶電顆粒在電場中泳動的現(xiàn)象

各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量等不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。不用支持物的利用支持物1）紙電泳2)淀粉凝膠電泳3)瓊脂糖凝膠電泳4）醋酸纖維薄膜電泳5）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）泳動度U泳動度：帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度U=v/E=dl/VtE:電場強度，每cm的電壓降，V/lv:顆粒的移動速度，d/td:顆粒的移動距離t:通電時間V:加在支持物兩端的實際電壓l:支持物的有效長度聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）Davis和Ornstein1959年人血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠：丙烯酰胺（Acr，單體）和N,N′-甲叉雙丙烯酰胺（Bis，交聯(lián)劑）共聚合而成（由過硫酸銨-四乙基乙二胺TEMED系統(tǒng)或核黃素-TEMED系統(tǒng)激發(fā)）。分子篩，可通過調(diào)節(jié)單體濃度或與交聯(lián)劑的比例來控制孔徑大小，達到不同的分離目的。凝膠可以是平板（垂直板型）或柱子（盤狀）作用使蛋白質(zhì)成為亞基物質(zhì)，形成蛋白質(zhì)-SDS膠束，消除蛋白質(zhì)分子之間的電荷、形狀差異；橢圓棒狀，短軸均為1.8nm，長軸正比于蛋白質(zhì)分子量。MW在15200kDa，電泳遷移率與分子量對數(shù)呈線性關(guān)系。logM=a-bRf，Rf為遷移率醋酸纖維薄膜電泳(CAME)以醋酸纖維薄膜(CAM)作支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)，將血清樣品點樣于醋纖膜上，在pH8.6的緩沖液中電泳，血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷移向正極。由于血清中各蛋白組分等電點不同而使表面凈電荷量不等，加之分子大小和形狀各異，因而電泳遷移率不同，彼此得以分離。電泳后，CAM經(jīng)染色和漂洗，可清晰呈現(xiàn)清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白5條區(qū)帶。器材1．醋酸纖維薄膜(8X2mm)

2．點樣器

3．染色皿，漂洗器，鑷子

4．電泳儀：電泳儀電源，水平電泳槽

試劑1．巴比妥緩沖液(pH8.6)：取巴比妥鈉12.76g，巴比妥1.66g，加蒸餾水加熱溶解后稀釋至1升。2．氨基黑10B染色液：取氨基黑10B0.5g，甲醇50ml，冰醋酸l0ml，加水至100ml。3．漂洗液：95％乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸餾水50ml

操作-準(zhǔn)備l．醋酸纖維薄膜(CAM)的準(zhǔn)備：薄膜放進緩沖液中，自然浸潤，約20分鐘。2．電泳槽的準(zhǔn)備：水平放置，將緩沖液注入電泳槽中，兩邊緩沖液高度一致，架上濾紙橋，蓋上電泳槽蓋.3．點樣：將充分浸透(指膜上無白色斑痕)的薄膜取出，用濾紙輕輕吸去膜上過多緩沖液，粗糙面(無光澤面)用于點樣，載玻片蘸取血清，垂直印在CAM粗糙面上。實驗報告將薄膜條粘貼于實驗報告，并標(biāo)