上一屆課件-重組dna技術(shù)

1binantDNATechnology重組DNA技術(shù)2重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展：1970年,Smith等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶;Khorana發(fā)現(xiàn)T4DNA連接酶為基因工程提供了有力的工具。

1972年,Berg等將SV-40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功。

1973年,Cohen創(chuàng)立了體外重組DNA技術(shù)的模式。

1979年,美國基因公司用人工合成的人胰島素基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中合成人胰島素。概述3克隆（clone）

在細(xì)胞學(xué)中，指通過無性繁殖過程產(chǎn)生成千上萬個與親代完全相同的子代群體。這一群體中的所有細(xì)胞具有完全相同的基因型和表型。（或指一個親本細(xì)胞產(chǎn)生成千上萬個相同細(xì)胞群體的過程）

DNA克隆的概念4“克隆”在分子生物學(xué)中，是指通過重組DNA(binantDNA)技術(shù)獲得具有相同DNA序列的單一基因或DNA片段的多個拷貝(copy)。

重組DNA技術(shù)是對DNA或基因進行操作，又是在分子水平上操作，因此又稱為

DNA克隆DNAcloning

基因克隆genecloning

分子克隆molecularcloning

5重組DNA技術(shù)的概念（binantDNAtechnology）應(yīng)用酶學(xué)方法，按照人的意愿，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作組裝成新的DNA分子，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進行擴增，形成大量的子代DNA分子、以獲得該

DNA分子的大量拷貝的過程。不同來源的DNA共價連接形成的新的DNA分子稱為重組DNA（binantDNA）。6DNA克?。―NAcloning）技術(shù)是分子生物學(xué)的核心技術(shù)，其中的關(guān)鍵技術(shù)是重組DNA技術(shù)。

DNA克隆的主要目的是獲得某一基因或DNA的大量拷貝。7DNA克隆的策略與技術(shù)路線1、獲得目的基因/目的DNA

2、目的基因與載體的酶切

3、目的基因與載體的連接

4、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞

5、篩選和鑒定含重組DNA分子的受體細(xì)胞

克隆89

DNA克隆的基本過程1、分：分離目的基因2、切：對目的基因和載體適當(dāng)切割3、接：目的基因與載體連接4、轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌5、篩：篩選出含有重組體的受體菌10第一節(jié)基因克隆重要的工具酶11

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶ⅠKlenow片段逆轉(zhuǎn)錄酶

TaqDNA聚合酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶DNA聚合酶

修飾酶

工具酶在重組DNA技術(shù)中有特殊的用途12

一、限制性核酸內(nèi)切酶

（restrictionendonuclease，限制酶）

定義:一類能識別雙鏈DNA分子中特定DNA堿基序列，并水解該序列內(nèi)部或附近的磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。

特點:

識別特定堿基順序（限制位點）

切割雙鏈DNA（磷酸二酯鍵）

核酸內(nèi)切酶

13

根據(jù)限制性酶的識別切割特性、催化條件以及是否具有修飾酶活性，分為I、II、

III型。通常所指的限制酶為II型限制性內(nèi)切酶。（一）限制酶的分類141.I型限制酶:

具有限制和修飾活性

輔助因子:Mg2+、ATP和SAM

識別和切割位點不一致:

在DNA鏈上沒有固定的切割位點，一般在識別位點外1Kb至7Kb處隨機切割，不產(chǎn)生特異片段。有甲基化作用152.II型限制酶：

即通常所用的限制性內(nèi)切酶；分子量小。輔助因子:Mg2+

切割位點在識別位點內(nèi)

：能識別和切割雙鏈

DNA的特異序列，產(chǎn)生特異的DNA片斷。無甲基化作用163.III型限制酶：

具有限制和修飾活性

分子量大輔助因子:Mg2+、ATP和SAM

特異切割位點在識別位點3’末端外24～26bp處有甲基化作用17第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序；前三個字母用斜體。（二）限制酶的命名HindⅢ

屬

系

株

序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶18（三）II型酶的識別、切割功能(1)以核酸內(nèi)切方式水解磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的

DNA片段，5’端為P基，3’端為OH基。(2)識別序列一般為4～8bp，通常具有回文結(jié)構(gòu)(Palindrome)19(3)切割DNA雙鏈可產(chǎn)生2種末端

平末端（bluntendsorflushends）

5’AGCT3’

AluⅠ5’AGpCT3’

3’TCGA5’3’TCp

GA5’粘性末端（stickyends

orcohesiveends）:

沿識別序列的對稱軸，對DNA的雙鏈同時交錯切割，產(chǎn)生具有互補堿基順序的游離的單鏈末端。205'端突出的粘性末端

5′

GGATCC3′

BamHI5′

GpGATCC3′3′

CCTAGG5′3′

CCTAGpG5′３′端突出的粘性末端

5′

GAGCTC3′

SacⅠ5′

GAGCTpC3′3′

CTCGAG5′3′

CpTCGAG5′21異源同裂酶（isoschizomer）

1、定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶

2、特點：1）識別相同順序

2）切割位點相同

KpnIGGTACC

Asp718GGTACCSstICCGCGG

SacICCGCGG

BamHIGGATCC

BstIGGATCC22

同尾酶（isocaudarner）5’G3’CAGCTTCGAG3’C5’+5’GTCGAG3’3’CAGCTC5’2、特點：1）識別不同順序

2）切割后的配伍末端相同SalIGTCGACCAGCTGXhoICTCGAGGAGCTC

1、定義：酶的來源不同，識別序列不同，但切割DNA后可產(chǎn)生相同的粘性末端（稱為:配伍末端compatibleend）23（四）影響限制酶切割效率的因素

1、底物純度

2、底物甲基化程度

3、底物結(jié)構(gòu)

4、反應(yīng)溫度

5、反應(yīng)體系組成24內(nèi)切酶的緩沖液：

10×Tris-HCl、NaCl、MgCl2pH為7.2-7.6

離子強度分為三個級別低鹽（10mmol/LNaCl）中鹽（50mmol/LNaCl）高鹽（100mmol/LNaCl）25

反應(yīng)體系和反應(yīng)終止

10XBuffer1ul

內(nèi)切酶1ulDNA樣品XuldH2Oto10ul26（五）限制酶的用途

1、DNA重組（基因克隆及亞克隆）

2、DNA限制酶（物理）圖譜繪制

3、突變分析（RFLP分析）

DNA限制性片段長度多態(tài)性分析

4、限制酶的部分酶切與完全酶切

5、DNA雜交與序列分析27

二、DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol)

指以dNTP為底物，催化dNTP聚合生成DNA

的一類酶。

281、大腸桿菌DNA聚合酶I

（E.coliDNApolymeraseI，全酶）

分子量為109kD，具有三種活性的多功能酶

5’→3’聚合酶活性

3’→5’外切酶活性

5’→3’外切酶活性用途(1)用切口平移方法標(biāo)記DNA探針

(2)合成第二條cDNA(3)DNA測序29大腸桿菌聚合酶I的3種酶活性：1．5’→3’DNA聚合酶的活性

302．3’→5’外切酶活性313．5’→3’外切酶活性32

是由大腸桿菌聚合酶I全酶，經(jīng)枯草桿菌蛋白酶（或木瓜蛋白酶）處理之后,產(chǎn)生出分子量為76kD的大片段分子,又稱Klenow聚合酶。2、Klenow片段（大腸桿菌DNA聚合酶I大片段）33323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個氨基酸（76kD）DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ

Klenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

34

作用：5’→3’聚合酶活性

3’→5’外切酶活性

用途：（1）標(biāo)記DNA片段的3’末端（2）在cDNA克隆中，用于cDNA第二鏈的合成（3）DNA序列測定

353、TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase)

特點：耐熱的DNA聚合酶，最佳作用溫度75-80C。具有5’3’聚合酶和5’3’外切酶活性，缺乏3’5’

外切酶活性，因而無校正閱讀功能。用途：（1）PCR

（2）DNA序列測定364、逆轉(zhuǎn)錄酶(ReverseTranscriptase,RTase)

特點以mRNA作為模板,以dNTP為底物，RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶(RDDP，RNA-dependentDNApolymerase

)

種類：禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）

Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV)

用途：（1）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

（2）補平或標(biāo)記5’粘端（3）DNA測序（4）制備探針3738(二)DNA連接酶(DNAligase)

作用：催化兩個相鄰DNA片段的3’-OH與5’–

磷酸基之間形成3’，5’磷酸二酯鍵。種類：T4DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶39HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’4041(三)修飾酶

T4多核苷酸激酶

(T4polynucleotidekinase)

堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)

甲基化酶42

T4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)

催化將ATP的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到DNA鏈的

5’-末端。用途：（1）放射性標(biāo)記DNA鏈的5’-末端，用于DNA

測序或探針制備。（2）將人工接頭和其它沒有5’-末端磷酸的

DNA片段磷酸化，用于連接反應(yīng)。

4344

堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）

作用：催化切除DNA、RNA的5’

磷酸基團種類：BAP

（bacterialalkalinephosphatase）

CIP

（calfintestinealkalinephosphatase）用途：

1.從RNA或DNA上除去5’磷酸，防止酶切后

DNA的自身環(huán)化

2.與T4多核苷酸激酶聯(lián)合，用于放射性標(biāo)記

DNA鏈的5’末端。4546

不依賴于模板的DNA聚合酶

——末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)

作用：催化dNTP摻入到DNA的3’-OH端用途：

1.給載體或cDNA加上互補的多聚體尾巴

2.DNA片段的3’末端標(biāo)記47481.RNase

用于除去DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的RNA分子。

1.RNaseA除去DNA樣品中的RNA分子

2.核酸酶S7

除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源mRNA(四)核酸酶（nuclease）

DNaseRNase2.RNaseH

作用于DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈，用于cDNA文庫建立時除去RNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成。

493.DNaseI1.特點：內(nèi)切酶，作用于ssDNA或dsDNA，但無核苷酸序列特異性(隨機切割)，產(chǎn)生5’-磷酸脫氧寡核苷酸。2.用途：

1)切口平移法，制備DNA探針

2)制備RNA樣品時除去DNA分子

3)基因突變時產(chǎn)生切口

5051ds-DNA結(jié)構(gòu):切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'52重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性內(nèi)切核酸酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除5′末端磷酸基53

第二節(jié)基因克隆的載體54定義：

攜帶目的DNA片段進入宿主細(xì)胞進行擴增和表達的工具（一類DNA分子）。載體的本質(zhì)：

DNA載體（vector）基因克隆的載體55載體的特征：

1.能自主復(fù)制

2.具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定

3.適當(dāng)大小

4.在細(xì)胞中拷貝數(shù)高

5.有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切位點（稱多克隆位點，即MCS-multiplecloningsites）56

載體的分類

功能克隆型載體（擴增）表達型載體宿主細(xì)胞真核細(xì)胞載體(表達/穿梭)

原核細(xì)胞載體(克隆/表達)

載體來源質(zhì)粒載體、病毒載體、噬菌體載體、昆蟲載體等

57克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。58常用的載體：

質(zhì)粒載體（plasmid）噬菌體載體（phage）粘粒載體（cosmid）酵母人工染色體載體病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒、腺相關(guān)病毒昆蟲載體

質(zhì)粒載體是最常用的載體59一、質(zhì)粒載體（一）質(zhì)粒的概念、種類

質(zhì)粒是游離于細(xì)菌染色體外的小型雙鏈環(huán)狀DNA，能自主復(fù)制，是賦予細(xì)菌的某些特性的輔助性遺傳單位。

功能并非細(xì)菌生長所必需，但對細(xì)菌的某些代謝活動和抗藥性的表型具有一定的作用。60分類(按復(fù)制機理):

嚴(yán)密型質(zhì)粒復(fù)制與宿主染色體同步;

在細(xì)菌中拷貝數(shù)低（1-3/cell）

松弛型質(zhì)粒（常用于基因工程克隆）可在無蛋白質(zhì)合成和染色體復(fù)制停止的情況下繼續(xù)復(fù)制;在細(xì)菌中拷貝數(shù)高(10-200/cell)

分子生物學(xué)中常用的質(zhì)粒：

松弛型質(zhì)粒（須經(jīng)人工改造）61

質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)?；A(chǔ)上經(jīng)人工改造而成的、攜帶目的DNA片段進入宿主細(xì)胞進行擴增和表達的工具。

*質(zhì)粒載體均帶有來源于pMB1（或ColE1）的復(fù)制子

*不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白*完全依靠宿主提供的酶（二）常用的質(zhì)粒載體62

1、pBR322

長度：4.36kb

篩選標(biāo)記：

AmprTetr

篩選方法：雙抗生素對照篩選

63優(yōu)點：1、分子量較小，為4363bp，不僅利于自身DNA的純化，可容納的外源DNA也較大。2、具有兩種抗菌素抗性基因可作為轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。3、具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素擴增后，每個細(xì)胞中可累積1000—3000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。642、pUC18/pUC19長度:2.69kb篩選標(biāo)記:

AmprLacZ篩選方法:

抗生素藍白篩選6566（三）質(zhì)粒載體的應(yīng)用質(zhì)粒載體克隆載體表達載體原核表達載體真核表達載體克隆載體pMD19-TpMD19-T是由pUC19載體的多克隆位點處的XbaI和SalI識別位點之間插入了EcoRV識別位點，用EcoRV進行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3'端添加"T"而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進行PCR反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物的3'末端添加一個"A"的特性，所以載體和目的基因可通過末端的T-A互補較好地進行連接，從而提高了載體與PCR產(chǎn)物之間的連接效率。69克隆載體的用途:

1.保存和擴增小于2kb的DNA片段

2.構(gòu)建cDNA文庫

3.用于目的DNA的測序

4.核酸雜交時的探針來源

表達載體的用途:

表達目的基因（基因治療，目的基因的研究、重組蛋白質(zhì)的制備等）質(zhì)粒載體的缺陷：

插入的外源DNA片段較小(<2kb)

拷貝數(shù)相對較少70

噬菌體(bacteriophage)是可以感染細(xì)菌的病毒,它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個蛋白質(zhì)外殼和尾巴,尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。二、噬菌體載體71

雙鏈?zhǔn)删w（λ噬菌體：改造λ噬菌體DNA）gt系列（插入型，適用cDNA克隆）EMBL系列（替換型，適用基因組克?。?/p>

單鏈?zhǔn)删w（M13：改造M13噬菌體DNA，含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列72（一）λ噬菌體

1、λ噬菌體的生物學(xué)特性

基因組特點：

有長12bp的互補粘性末端（cos位點，粘端）

兩種生長方式：溶菌性生長（裂解性生長）溶源性生長

73λ噬菌體的生活史74Cos位點（Cohesive-endsite）：

λDNA為線狀雙鏈分子，兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端，通過粘性末端的互補作用形成雙鏈環(huán)形DNA。這種由粘末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段即Cos位點。coscos頭、尾attcIcIIIcrocII非必要區(qū)溶菌cosDNA合成頭部合成尾部合成762.λ噬菌體載體

（1）插入載體(insertvector)<7Kbλgt10、λgt11

cIEcoRIlacZ’EcoRIλgt10λgt1177（2）替換載體(subsitutionorreplacevector)

基因組中有14kb的非必需區(qū)，可被外源DNA替換，可達23Kb。非必需區(qū)兩側(cè)有一對限制性酶切位點

如：EMBL4E,B,SS,B,EEcoRIBamHISalI78三、粘粒載體（cosmid）

粘粒：由質(zhì)粒和噬菌體的cos粘性末端構(gòu)建而成（含λ噬菌體cos區(qū)域的質(zhì)粒）。特點：質(zhì)粒復(fù)制起點限制性內(nèi)切酶位點抗藥性基因噬菌體兩端的cos位點優(yōu)點：相對分子質(zhì)量小，4~6kb

插入能力大，達40~50kb7980四、M13噬菌體

M13噬菌體是單鏈環(huán)狀DNA分子，感染細(xì)菌后，其基因組DN