免疫細胞分離與功能檢測

免疫細胞分離與功能檢測第一頁，共五十八頁，2022年，8月28日目的要求

掌握：Ficoll-hypaque分層液分離PBMC的原理、方法，淋巴細胞亞群分離的原理、方法及應用，T細胞增殖試驗的方法，B細胞的數(shù)量及功能的檢測；熟悉：T細胞功能的體內(nèi)試驗，T細胞介導的細胞毒檢測的方法；了解：淋巴細胞的純化與亞群分離的方法、吞噬細胞的分離方法、溶血空斑試驗。第二頁，共五十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)免疫細胞的分離第三頁，共五十八頁，2022年，8月28日免疫細胞的分離及檢測※檢測：各類免疫細胞及其亞群的數(shù)量和功能測定※方法：體外法為主※目的：判斷機體免疫狀態(tài)※意義：探討疾病的發(fā)病機制、發(fā)展、預后、療效免疫細胞的分離是指將各種參與免疫反應的細胞從血液或組織中分離出來4第四頁，共五十八頁，2022年，8月28日

免疫細胞的起源與分化紅細胞血小板肥大細胞中性粒細胞巨噬細胞樹突狀細胞漿細胞T細胞NK細胞第五頁，共五十八頁，2022年，8月28日免疫細胞種類第六頁，共五十八頁，2022年，8月28日免疫細胞的分離流程外周血PBMC純淋巴細胞T、B細胞TC亞群/BC亞群第七頁，共五十八頁，2022年，8月28日PBMC包括：淋巴細胞、單核細胞各種血細胞比重不同,利用密度梯度離心進行分離常用分層液：ficoll－h(huán)ypaque，percoll一、外周血單個核細胞的分離和純化第八頁，共五十八頁，2022年，8月28日細胞比重血小板1.030~1.035PBMC1.075~1.090多核白細胞1.092紅細胞1.093外周血各細胞成分的密度第九頁，共五十八頁，2022年，8月28日

Ficoll分離液法是一種單次差速密度梯度離心的分離法，主要用于分離外周血中的單個核細胞。Ficoll分層液：密度1.077±0.001離心：密度梯度離心分離：各類細胞按其相應密度重新分布

一、Ficoll分離法第十頁，共五十八頁，2022年，8月28日Ficoll分層液分離單個核細胞示意圖第十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日二、淋巴細胞的分離

純淋巴細胞群的采集原理：利用單核細胞在37℃和Ca離子存在條件下，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性，據(jù)此建立許多從單個核細胞中除去單核細胞的方法，以獲得高純度的淋巴細胞群。第十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日(一)粘附貼壁法因B細胞也有貼壁現(xiàn)象，因此，本法分離的淋巴細胞群中B細胞有所損失。(二)吸附柱過濾法

將單核細胞吸附于玻璃柱中，洗脫下來的主要是淋巴細胞第十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日(三)磁鐵吸引法利用單核細胞具有吞噬的特性，在懸液中加入羰基鐵顆粒，待單核細胞吞噬鐵顆粒后，用磁鐵將細胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細胞群。第十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日78％98％（四）Percoll分離法返回章目錄第十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日三、T、B細胞和T細胞亞群的分離免疫磁珠分離法流式細胞術分離法其他方法第十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日（一）免疫磁珠分離法

第十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日488nm激光+-前向散射光檢測器

熒光檢測器電磁場單個細胞被分類進入檢測管流式細胞術分離原理示意圖第十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)淋巴細胞表面標志的檢測及亞群分類第十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日一、T細胞表面標志及亞群CD4+TCD8+TCD3+CD4+CD8-CD3+CD4-CD8+主要為Th（helpTcell）輔助性T細胞主要為Tc（cytotoxicTcell）細胞毒性T細胞第二十頁，共五十八頁，2022年，8月28日二、B細胞表面標志及亞群亞群第二十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日NK細胞典型標志：CD56和CD16三、NK細胞表面標志第二十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日第三節(jié)抗原提呈細胞表面標志抗原提呈細胞（APC）：是指能攝取、加工、處理抗原，并將抗原信息提呈給抗原特異性淋巴細胞的一類免疫細胞。單核-巨噬細胞樹突狀細胞第二十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日（1）分泌TNF-α、NO、反應氧中間產(chǎn)物及蛋白水解酶等（2）ADCC效應（3）激活T細胞產(chǎn)生細胞因子等活化巨噬細胞協(xié)同殺傷腫瘤細胞。（一）單核吞噬細胞（CD14）1.吞噬和殺傷作用2.殺傷腫瘤細胞第二十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日形態(tài)呈樹突樣具有一些相對特征性表面標志抗原提呈能力強能激活初始T細胞免疫應答的始動者二、樹突狀細胞（dendriticcells，DC）特征：第二十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日1.起源于造血干細胞由髓樣干細胞（多數(shù)）、淋巴干細胞分化。2.表面標志豐富如：MHCⅡ類分子及Ⅰ類分子、B7-1和B7-2、CD40、CD1以及粘附分子等。3.分泌多種細胞因子

IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-α等。DC主要標志：CD1a、CD11c、CD83第二十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日第四節(jié)T細胞功能檢測一、T細胞功能檢測第二十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日淋巴細胞DNA合成分化母細胞刺激物細胞變大細胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松（一）T淋巴細胞增殖試驗第二十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日形態(tài)學檢查法3H-TdR摻入法MTT比色法淋巴細胞轉(zhuǎn)化的檢測方法第二十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日形態(tài)學檢查法第三十頁，共五十八頁，2022年，8月28日

轉(zhuǎn)化的淋巴細胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞淋巴母細胞過渡型細胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細胞的形態(tài)特征第三十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日原理：刺激物37℃56hG1期→S1期

合成DNA↑

3H-TdR37℃16hDNA-3H-TdR測淋巴細胞內(nèi)放射量（cpm）計算SI判斷淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度外周血（T）G0期3H-TdR摻入法第三十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日評價：該方法敏感性高、客觀性強、重復性好、可自動操作；設備昂貴、放射污染。

刺激指數(shù)（stimulatingindex，SI）

SI=試驗管cpm均值/對照管cpm均值3H-TdR摻入法第三十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日放射性測定3H-TdR絲裂原（抗原）刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗原理示意3H-TdR摻入法第三十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日原理:用刺激劑體外激活淋巴細胞，用蛋白轉(zhuǎn)運抑制如莫能霉素阻止細胞因子分泌到細胞外，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運方式被打亂，引起細胞因子向高爾基體積聚，用流式細胞儀便可測出淋巴細胞內(nèi)的細胞因子種類，從而確定TH1/TH2細胞的百分率。淋巴細胞內(nèi)細胞因子檢測（二）T細胞分泌功能檢定第三十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日分泌的細胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++

Thl和Th2分泌的細胞因子第三十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日原理:靶細胞抗原T細胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細胞（三）T細胞介導的細胞毒試驗第三十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日試驗方法:同位素法

淋巴細胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細胞腫瘤細胞破壞51Cr釋放測定γ射線51Cr特異釋放率=

×100%（三）T細胞介導的細胞毒試驗第三十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日（三）T細胞介導的細胞毒試驗背景無效應細胞效應細胞/靶細胞1:1效應細胞/靶細胞5:1效應細胞/靶細胞20:1細胞溶解第三十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日特異性抗原皮膚試驗PHA皮膚試驗（四）體內(nèi)試驗第四十頁，共五十八頁，2022年，8月28日溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗體內(nèi)試驗二、B細胞功能檢測第四十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日（一）溶血空斑試驗溶血斑補體抗血清包被綿羊紅細胞第四十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日（二）酶聯(lián)免疫斑點法抗體產(chǎn)生B細胞抗原包被酶聯(lián)抗抗體凝膠底物顯色第四十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日刺激體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風類毒素、多價肺炎鏈球菌等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應抗體的效價，判斷受檢者體內(nèi)B細胞的功能。（三）體內(nèi)試驗第四十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日染色計數(shù)離心取上清測LDH或AKP測發(fā)光強度測CPM值形態(tài)法酶釋法放射性核素釋放法流式細胞術靶細胞溶解常用靶細胞:K562細胞株三、NK細胞活性檢測返回章目錄第四十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日

﹡大吞噬細胞:即單核-吞噬細胞系統(tǒng)

﹡小吞噬細胞:即中性粒細胞第五節(jié)其他免疫細胞功能檢測技術吞噬細胞的種類第四十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日特征性標志CD14分離技術Pecoll密度梯度分離法流式細胞儀分離技術免疫磁珠分離法：為目前較常用的方法黏附法一、吞噬細胞的分離（一）單核細胞的分離第四十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日☆斑蝥敷貼法分離人巨噬細胞☆動物的巨噬細胞直接從腹腔滲出液中獲取（二）巨噬細胞的分離第四十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日聚合物加速沉降法可從外周血中分離出白細胞RBC血漿(抗凝血)WBCRBC

Ficoll分離法可從白細胞中分離出純化的中性粒細胞（三）中性粒細胞的分離第四十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離中性粒細胞第五十頁，共五十八頁，2022年，8月28日吞噬細胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應的檢測方法。（一）中性粒細胞功能檢測技術（二）巨噬細胞功能檢測技術二、相關功能檢測第五十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日細胞趨化功能的檢測吞噬功能的檢測殺菌功能的檢測（一）中性粒細胞功能檢測第五十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日體內(nèi)試驗法：皮膚窗法體外試驗法：濾膜滲透法瓊脂糖平板法趨化功能檢測——檢測細胞運動功能皮膚窗法在受檢者前臂屈側中央3㎜范圍內(nèi)，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2，5，8，12，24，36小時各取樣一次，染色觀察中性粒細胞聚集開始時間、聚集程度等。健康正常人一般2～3h后開始聚集，達50～100個，6小時可達1000個以上。

第五十三頁，共五十八頁，2022