知識(shí)金牌-轉(zhuǎn)錄組系列1測(cè)序在醫(yī)學(xué)方向研究應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在醫(yī)學(xué)方向的研究應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)解螺旋|知識(shí)金牌上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司

美吉生物01轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)介02轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用03實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)04取樣保存注意事項(xiàng)CONTENTS課程目錄轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)介01第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展一、轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)錄組是特定物種、組織或細(xì)胞在特定生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄的所有RNA的集合，包括mRNA和非編碼RNA（Non-codingRNA）。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠快速獲得mRNA表達(dá)譜；根據(jù)測(cè)定的序列同時(shí)可以對(duì)SNP、可變剪接等轉(zhuǎn)錄本的序列及結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行精確地分析。此外，通過(guò)不同的文庫(kù)構(gòu)建策略，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠發(fā)現(xiàn)大量的ncRNA，并且對(duì)其表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；當(dāng)進(jìn)一步開(kāi)展ncRNA與mRNA的關(guān)聯(lián)分析時(shí)，就可以深入研究ncRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（ceRNA）。DNAProtein蛋白質(zhì)Translation翻譯Transcription轉(zhuǎn)錄ReverseTranscription逆轉(zhuǎn)錄RNA第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展一、轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)介mRNAmiRNAlncRNAcircRNA我懵懂無(wú)知時(shí)你說(shuō)：mRNA是蛋白質(zhì)翻譯的唯一，我奉為圭臬；后來(lái)你說(shuō)，microRNA是眾人追捧的明星，我堅(jiān)信不疑；前年你說(shuō)，lncRNA才是時(shí)尚界的寵兒，我半信半疑；最近你又說(shuō)，circRNA才是未來(lái)的新星，我……能不能少一點(diǎn)套路，多一點(diǎn)真誠(chéng)！第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展一、轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)介ceRNA（competingendogenousRNA）是由美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究小組于2011年在《細(xì)胞》上提出的一項(xiàng)假說(shuō)，其核心內(nèi)容：具有相同miRNA應(yīng)答元件（MiRNAResponseElement，MRE)的mRNA、假基因轉(zhuǎn)錄物、lncRNA等轉(zhuǎn)錄物通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合同種miRNA來(lái)調(diào)控各自的表達(dá)水平，從而影響細(xì)胞的功能。近年來(lái)多項(xiàng)研究已證實(shí)了該假說(shuō)的真實(shí)性。所以，ceRNA并不是一類RNA分子，而是一個(gè)假說(shuō)，一種調(diào)控機(jī)制。第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展一、轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)介AccordingtoceRNAhypothesis,competingendogenousRNAs(ceRNAs)memberscancompeteforthesameMREstoregulateeachother.RNAtranscriptscommunicatethroughtheceRNAlanguage.轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用02第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用1、生長(zhǎng)發(fā)育研究：胚胎發(fā)育、生長(zhǎng)發(fā)育、衰老死亡通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以找到不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、不同成長(zhǎng)條件、不同組織器官顯著差異表達(dá)、特異表達(dá)的mRNA和非編碼RNA，通過(guò)進(jìn)行功能注釋（GO、KEGG等）和富集分析等，可以找到特異的biomarker；同時(shí)，通過(guò)將mRNA和非編碼RNA進(jìn)行聯(lián)合分析，還可深入挖掘表型性狀背后存在的復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用HanX,WangR,etal.MappingtheMouseCellAtlasbyMicrowell-seq[J].Cell.2018,172:1091–1107.第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用1、IdentificationofRNA-RNApairs(mRNA-mRNA,lncRNA-lncRNA,mRNA-lncRNA)thatsignificantlyco-regulatedbymiRNAs2、ScreeningcandidateceRNApairswithhighsimilarityofmiRNAregulationpattern3、DiscoveringceRNAinteractionunderlyingrhesustissuedevelopment.第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用ThefourceRNETsobtainedfordifferenttissues.(A–D)ThefourceRNETsobtainedforbrain,liver,colon,andlungtissues.Thecolorgradientrepresentsdifferentclusters.(E)VenndiagramshowingtheoverlappingrelationshipsoftheceRNAsinthefourceRNETs.(F)ThedegreedistributionsofthefourceRNETs.第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用K-meansclusteringanalysisgroupedtheceRNAsintheceRNETsintodifferentclusters.第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用lncRNAswithcharacteristicexpressionpatternrelatedtotissuedevelopment.(A)ThreelncRNAsinteractedcloselywiththethreecodinggenes(MYB,AMOTandMBNL1)andtheirpartnersintheceRNETs.MostoftheseceRNAswerehighlyexpressedduringtheearlyprenatalliverdevelopment.(B)ThreelncRNAsinteractedwiththethreecodinggenesbycompetitivelybindingmanydevelopment-relatedmiRNAs.LabelsshowthedevelopmentrelatedmiRNAs.第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用SomeceRNAinteractionsonlybecameactiveduringspecificdevelopmentstageandtheymediatedthecrosstalkamongkeypathwaysinbraindevelopment.第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用2、藥理研究：藥物作用效果及作用機(jī)制（靶點(diǎn)）、新藥開(kāi)發(fā)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以研究不同類型、不同劑量濃度、不同作用時(shí)間等的藥物處理對(duì)機(jī)體作用情況及其內(nèi)在的作用機(jī)理。通過(guò)對(duì)顯著差異表達(dá)、特異表達(dá)的mRNA和非編碼RNA，通過(guò)進(jìn)行功能注釋（GO、KEGG等）和富集分析等，同時(shí)，通過(guò)將mRNA和非編碼RNA進(jìn)行聯(lián)合分析，可以研究檢測(cè)藥物對(duì)基因表達(dá)的影響情況，從而了解藥物影響機(jī)體代謝和生理病理的情況，為藥理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用馬兜鈴酸處理大鼠腎臟mRNA-miRNA應(yīng)答情況ratkidney，10mg/kgAA，12weeks，eightkidneysamples(4treatmentand4control)

miRNAmRNAmiR-21,miR-34a,miR-122,andmiR-135a第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用黃連素通過(guò)調(diào)控肝臟mRNA和lncRNA表達(dá)改善非酒精性脂肪肝HFD-inducedobeserats：ND,HFDandHFD+BBRHFD+BBRvsHFDHFDvsND第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用3、免疫研究：免疫反應(yīng)、自體免疫病通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以找到不同病原微生物、異物等引起的機(jī)體顯著差異表達(dá)、特異表達(dá)的mRNA和非編碼RNA，通過(guò)進(jìn)行功能注釋（GO、KEGG等）和富集分析等，可以找到關(guān)鍵性作用的免疫功能基因；同時(shí)，通過(guò)將mRNA和非編碼RNA進(jìn)行聯(lián)合分析，還可深入挖掘免疫反應(yīng)背后存在的復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。AlexanderJ.Westermann

etal.,NATUREREVIEWSMICROBIOLOGY,2012

互作轉(zhuǎn)錄組與傳統(tǒng)研究方式相比優(yōu)勢(shì)：可同時(shí)研究?jī)煞N或更多的物種；無(wú)需分離，排除分離帶來(lái)的影響；成本降低，只構(gòu)建一個(gè)文庫(kù)，同時(shí)分析兩個(gè)物種。第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用1).Sampleswerecollectedat1,4and24hpostinfection(hpi)；2).RNAsequencing(RNA-seq)ofpoly-AselectedmessengerRNA(mRNA)andsmallRNA-seq(sRNA-seq)at1,4and24hpi.18.7and0.7millionreads3).strand-specificRNAlibraries,~200–260bp,single-endsequencedonanIlluminaHiSeq2000.sRNA147–157nt,single-endsequencedonanIlluminaHiSeq2000.Unsupervisedhierarchicalclusteringinfectedsamplesfromthe4and24hpitimepointsclusteredseparatelyfromall1hpisamples,indicatingcleartemporalalterationsingeneexpressiondrivenbytheinfectionprocess.At1,4and24hpi,weidentified12,539and1480DEgenes,respectively,betweenMABR-infectedcellsanduninfectedcontrols第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用STAT1isessentialtothehostdefenseagainstmycobacterialinfection;SRCisknowntobeinvolvedinregulatingnumerousdownstreaminflammatorysignalingpathways;EGR1hubofthehostresponsenetworkphagolysosomeacidificationandtheinductionofautophagy.miRNAtargetpredictionsusingToppMiR.miR-181dmediatesinflammatoryresponsesthroughtheregulationofPI3KandNF-κBsignaling;miR-146,aspartoftheantimicrobialresponseinmacrophages.第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用4、疾病研究：腫瘤、代謝性疾病、神經(jīng)性疾病...通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以獲得腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中相關(guān)基因mRNA和非編碼RNA的結(jié)構(gòu)變異情況、表達(dá)差異情況和特異性表達(dá)情況，研究腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，鑒定biomarker，協(xié)助疾病診斷、疾病監(jiān)控和治療以及藥物靶點(diǎn)研究、藥物開(kāi)發(fā)等。第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用ComprehensiveanalysisoflncRNA-mRNAco-expressionpatternsidentifiesimmuneassociatedlncRNAbiomarkersinovariancancermalignantprogression.在卵巢癌中通過(guò)lncRNA-mRNA共表達(dá)分析鑒定與免疫相關(guān)的lncRNA生物標(biāo)志物對(duì)399個(gè)卵巢癌患者取樣，通過(guò)lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，鑒定出兩個(gè)lncRNA（RP11-284N8.3.1andAC104699.1.1）不僅在卵巢癌發(fā)展過(guò)程中表達(dá)具有差異性，而且能預(yù)測(cè)不同發(fā)展時(shí)期病人的預(yù)后；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)lncRNA在lncRNA-mRNAregulatorynetwork(OVLMN)中位置臨近，推測(cè)共同調(diào)節(jié)病人的發(fā)展階段。功能分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)lncRNA在免疫系統(tǒng)的活化和抗腫瘤過(guò)程中發(fā)揮作用，子卵巢癌模型中這兩個(gè)lncRNA可以作為病人病情發(fā)展階段的評(píng)估標(biāo)志物。該兩個(gè)lncRNA可以作為患者的潛在生物標(biāo)志物，為靶向藥物開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。136個(gè)lncRNA（前5%nodes，hub）399個(gè)lncRNA與mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)536個(gè)lncRNA差異表達(dá)9個(gè)lncRNA(與生存期相關(guān))2個(gè)lncRNA（預(yù)后biomarker）單變量共表達(dá)分析風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型136個(gè)lncRNA（前5%nodes，hub）399個(gè)lncRNA與mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用為了進(jìn)一步篩選，分析lncRNA和mRNA的關(guān)系，選擇lncRNA-mRNApairs(P<0.01)做共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中包括399個(gè)lncRNA和2634個(gè)mRNA(8393個(gè)共表達(dá)關(guān)系)比較卵巢癌stageIII和IV與stageII的基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)有536個(gè)差異的lncRNAs和9053個(gè)差異mRNAs；對(duì)其degree和betweennesscentrality（BC）進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)最高的50個(gè)degreenodes和20個(gè)BCnodes都是lncRNA。表明:在卵巢癌惡化過(guò)程中，lncRNAs表現(xiàn)出很高的特異性。第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用篩選了排名前5%（151個(gè)）的nodes作為hubs，其中包括136個(gè)lncRNAs。通過(guò)分析其與生存期的關(guān)系，進(jìn)一步縮小篩選范圍；單變量共表達(dá)分析（aunivariateCoxregressionanalysis），找到9個(gè)lncRNA與病人生存期有關(guān)；構(gòu)建一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型（ariskscoremodel）：trainingset(n=199)和testingset(n=200)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)lncRNA：RP11-284N8.3.1和AC104699.1.1，可以把病人分成的高風(fēng)險(xiǎn)與低風(fēng)險(xiǎn)組。第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用5、外泌體：外泌體exosome，是細(xì)胞分泌的大小為30-100nm的微小囊泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，廣泛存在于所有體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體包含多種活性分子，如蛋白質(zhì)、脂肪和核酸（mRNA、miRNA及其它非編碼RNA）等，能作為信號(hào)分子傳遞給靶細(xì)胞，從而介導(dǎo)細(xì)胞間的物質(zhì)傳遞與信息交流。1983年Johostone等首次發(fā)現(xiàn)外泌體的存在，早期這種小囊泡被認(rèn)為是一種細(xì)胞廢棄物，有關(guān)其研究進(jìn)展緩慢。然而近年來(lái)，外泌體已成為科研熱點(diǎn)，其在臨床上巨大的應(yīng)用價(jià)值，引起了眾多研究者以及商業(yè)人士的濃厚興趣。隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)外泌體在臨床的診斷、治療及預(yù)后中的應(yīng)用研究正在蓬勃開(kāi)展。目前，外泌體在癌癥的診斷、治療及預(yù)后中的應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)，其在生物標(biāo)記物、腫瘤轉(zhuǎn)移、藥物載體和靶點(diǎn)、免疫、心腦血管、損傷修復(fù)等多個(gè)領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展。TiezhengYuan,XiaoyiHuang,etal.PlasmaextracellularRNAprofilesinhealthyandcancerpatients.SciRep,2016,6:19413第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展二、轉(zhuǎn)錄組在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用LiL,LiC,WangS,etal.ExosomesderivedfromhypoxicoralsquamouscellcarcinomacellsdelivermiR-21tonormoxiccellstoelicitaprometastaticphenotype[J].Cancerresearch,2016,76(7):1770-1780實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)03第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)組合濃度、劑量梯度時(shí)間梯度年齡組成性別遺傳背景發(fā)育、病情階段處理差異物理（理療...）化學(xué)（藥劑...）生物（病原菌...）樣本差異樣本個(gè)體差異樣本類型差異組織器官（單）細(xì)胞血液根據(jù)研究目的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)外泌體第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)取樣腫瘤實(shí)體瘤流體瘤生長(zhǎng)發(fā)育生殖細(xì)胞胚胎細(xì)胞細(xì)胞系藥理研究動(dòng)物模型、細(xì)胞系臨床病人（病灶、血液）免疫研究免疫細(xì)胞免疫組織、器官神經(jīng)性疾病動(dòng)物模型、細(xì)胞系臨床病人（腦、細(xì)胞）代謝性疾病動(dòng)物模型臨床病人（病灶、血液）……取樣注意：隨機(jī)性：避免系統(tǒng)誤差，減少誤差來(lái)源普遍性：減少個(gè)體差異一致性：非實(shí)驗(yàn)變量保持一致實(shí)驗(yàn)組的生物學(xué)重復(fù)一般建議＞5-10個(gè)，一個(gè)人即為一個(gè)重復(fù)；對(duì)照組的生物學(xué)重復(fù)可稍比實(shí)驗(yàn)組少一些（同病不同癥）；第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)取生物學(xué)重復(fù)的原因減少組內(nèi)個(gè)體差異的干擾，體現(xiàn)真實(shí)的組間差異；評(píng)估差異表達(dá)基因的可靠性；生物學(xué)重復(fù)的相關(guān)性可以輔助篩查異常的樣本；檢驗(yàn)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作的可重復(fù)性；如不設(shè)生物學(xué)重復(fù)，部分雜志可能會(huì)因此拒稿。ConesaA,MadrigalP,TarazonaS,etal.AsurveyofbestpracticesforRNA-seqdataanalysis[J].GenomeBiology,2016,17(1):13.第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)研究層面文庫(kù)構(gòu)建測(cè)序量分析項(xiàng)目mRNA真核轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)6Gcleandata1、序列結(jié)構(gòu)分析：SNP、可變剪切、新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)2、表達(dá)差異分析及功能注釋富集分析miRNAsmallRNA文庫(kù)10Mrawreads1、miRNA鑒定及新miRNA預(yù)測(cè)2、差異表達(dá)miRNA分析3、差異表達(dá)miRNA靶基因分析lncRNA去rRNA鏈特異性文庫(kù)10Gcleandata1、lncRNA鑒定及新lncRNA預(yù)測(cè)2、差異表達(dá)lncRNA分析3、差異表達(dá)lncRNA靶基因分析circRNA去rRNA去線性鏈特異性文庫(kù)10Gcleandata1、circRNA鑒定及新circRNA預(yù)測(cè)2、差異表達(dá)circRNA分析3、差異表達(dá)circRNA靶基因分析全轉(zhuǎn)錄組去rRNA鏈特異性文庫(kù)+smallRNA文庫(kù)15Gcleandata+10Mrawreads1、mRNA及ncRNA表達(dá)差異分析2、差異表達(dá)ncRNA靶基因分析3、mRNA及ncRNA關(guān)聯(lián)分析（ceRNA）第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)取樣保存注意事項(xiàng)04第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展四、取樣保存注意事項(xiàng)1.實(shí)驗(yàn)工具和環(huán)境去除內(nèi)源性/外源性RNase實(shí)驗(yàn)人員須穿好實(shí)驗(yàn)服，戴上手套和口罩，所用到的耗材和器皿以及實(shí)驗(yàn)區(qū)域要在RNA提取前進(jìn)行RNase清除（高溫干熱/濕熱滅酶、使用RNA酶抑制劑）處理。研缽剪刀鑷子手術(shù)刀EP管托盤(pán)槍頭第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展四、取樣保存注意事項(xiàng)RNAlater4℃過(guò)夜，-20℃或-80℃長(zhǎng)期保存液氮速凍，-80℃保存0102細(xì)胞加入裂解液反復(fù)吹打至裂解充分，液氮速凍-80℃保存03第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展四、取樣保存注意事項(xiàng)組織取樣（建議送樣量≥1g）無(wú)酶凍存管，液氮中預(yù)冷；活體上迅速取下組織（切成黃豆粒大小的塊狀）；RNase-free水配制1xPBS或生理鹽水快速清洗組織表面的污漬，吸干表面液體后收集進(jìn)凍存管（管的下部分保持在液氮中）；液氮速凍；-80℃保存或干冰運(yùn)送，避免反復(fù)凍融；樣本注意分裝和備份干冰或低溫冰箱的降溫速度較緩慢，不能及時(shí)抑制RNase的活性而引起樣本降解，因此需在最短時(shí)間內(nèi)將樣本轉(zhuǎn)移至液氮中保存，徹底冷凍后再轉(zhuǎn)移到-80℃。第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展四、取樣保存注意事項(xiàng)將新鮮組織切割成規(guī)定的大小，按比例加入RNAlater中；將樣本置于4°C保存過(guò)夜（使RNAlater完全滲透組織）；轉(zhuǎn)移至-20℃或-80℃長(zhǎng)期保存；為避免組織塊在運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中露出液面，應(yīng)將RNAlater灌滿管子。組織取樣（建議送樣量≥1g）僅適用于新鮮組織樣本，不適用已冷凍保存的組織樣本、骨頭及表皮蠟質(zhì)豐富的植物。不建議用RNAlater保存液體樣本（RNAlater會(huì)與液體樣本發(fā)生互溶）。第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展四、取樣保存注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)：不建議寄送用裂解液保存的組織樣本。除了用trizol保存細(xì)胞的樣本外，用裂解液保存的組織樣本，無(wú)論是研磨好的粉末還是切割好的組織塊，所抽提的RNA質(zhì)量普遍較差。RNAlater及類似保存液保存的樣本，按說(shuō)明將組織切小塊。組織塊過(guò)大會(huì)影響RNAlater滲透入組織內(nèi)部的效率，也會(huì)造成RNAlater無(wú)法完全覆蓋組織，而未被覆蓋的組織部位極易被RNase降解。組織取樣（建議送樣量≥1g）第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展四、取樣保存注意事項(xiàng)細(xì)胞樣本采集（建議送樣量：>細(xì)胞數(shù)5X106

）貼壁細(xì)胞的處理：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）細(xì)胞，確定細(xì)胞數(shù)量；用1XPBS洗滌細(xì)胞，離心棄PBS，洗1-2次；加入適量裂解液反復(fù)吹打至裂解充分；轉(zhuǎn)移至離心管中，-80℃保存；懸浮細(xì)胞的處理：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞懸液，確定細(xì)胞數(shù)量；離心，吸除細(xì)胞培養(yǎng)基，1XPBS洗滌，離心棄PBS，洗1-2次；加入適量裂解液反復(fù)吹打至裂解充分；轉(zhuǎn)移至離心管中，-80℃保存；按每10cm2（相當(dāng)于六孔板一個(gè)孔或35mm直徑培養(yǎng)皿）細(xì)胞加1mLTRIzol試劑的比例按照每5×106

個(gè)細(xì)胞加1mLTRIzol的比例第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展四、取樣保存注意事項(xiàng)細(xì)胞樣本采集（建議送樣量：>細(xì)胞數(shù)5X106

）注意事項(xiàng)：細(xì)胞必須裂解充分后再寄送，勿將凍干的細(xì)胞直接寄送；細(xì)胞樣品胰酶消化要注意把握消化程度，胰酶會(huì)消化細(xì)胞膜上的膜蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，破裂的細(xì)胞會(huì)釋放RNase導(dǎo)致RNA降解；對(duì)于1-1000個(gè)細(xì)胞（微量樣本），須保存在專門(mén)的細(xì)胞裂解液中，應(yīng)標(biāo)明細(xì)胞數(shù)量（跟PCR實(shí)驗(yàn)循環(huán)數(shù)相關(guān)）第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展四、取樣保存注意事項(xiàng)細(xì)菌樣本采集（建議送樣量：>1x109個(gè)）收集對(duì)數(shù)期（OD600:0.8-1）的菌液，確定細(xì)菌數(shù)量；取500μl的菌液置于1.5ml離心管（RNase-free）中，離心去上清；菌體沉淀加入trizol混勻（革蘭氏陽(yáng)性菌需要先研磨充分），裂解充分。放入液氮速凍，一個(gè)樣本請(qǐng)?zhí)峁┻@樣的3-5管菌體；液氮速凍后的樣本，放-80℃保存，干冰送樣。第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展四、取樣保存注意事項(xiàng)真菌樣本采集（建議送樣量：至少3管菌絲體）取500μl的菌液，離心去上清（每管200mg）；將菌絲體沉淀迅速置于液氮中冷凍>1h；轉(zhuǎn)移至-80℃保存；第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展四、取樣保存注意事項(xiàng)血液樣本采集（建議送樣量：≥2ml）使用抗凝采血管（不建議使用肝素抗凝管）采集全血；采血后輕輕倒轉(zhuǎn)采血管混合4-5次，使抗凝劑與血液混勻；快速轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的凍存管中，按照1ml/管分裝，加5ml(即5倍體積)Trizol/TrizolLS，混勻；液氮速凍后，放-80℃冰箱保存；注意事項(xiàng)：每個(gè)環(huán)節(jié)盡可能的快速完成，避免RNA的降解。臍帶血采集，請(qǐng)具體咨詢技術(shù)同事。第一部分|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展四、取樣保存注意事項(xiàng)血清/血漿樣本采集（建議送樣量：250μl/管，3管）血漿使用抗凝采血管（不建議使用肝素抗凝管）采集全血；采血后輕輕倒轉(zhuǎn)采血管混合4-5次，使抗凝劑與血液混勻；直立置于4℃待血液完全凝固，離心，分離血漿；液氮速凍后，放-80℃冰箱保存?？鼓齽┩扑]：ED