常用分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)實驗技術(shù)介紹

第第頁常用分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)實驗技術(shù)介紹！核酸分子雜交技術(shù)

由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有肯定同源性的原條核酸單鏈在肯定的條件下（相宜的溫室度及離子強度等）可按堿基互補原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針（probe）,待測核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補的已知DNA或RNA片段。依據(jù)其來源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。

固相雜交

固相雜交（solid-phasehybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。

斑步雜交（dothybridization）

是道先將被測的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過量的標(biāo)記好的DNA或RNA探針進行雜交。該法的特點是操作簡潔，事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電永分別核酸樣品，可在同一張膜上同時進行多個樣品的檢測；依據(jù)斑點雜并的結(jié)果，可以推算出雜交陽性的拷貝數(shù)。該法的缺點是不能鑒定所測基因的相對分子質(zhì)量，而且特異性較差，有肯定比例的假陽性。

印跡雜交（blottinghybridization）

Southern印跡雜交：凝膠電離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的已標(biāo)記的探針進行那時交反應(yīng)，用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色，檢測特定大小分子的含量?？蛇M行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長度多態(tài)性分析（RELP）等。

Northern印跡雜交:由Southerm印雜交法演化而來，其被測樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分別后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，進行雜交反應(yīng)，以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小。該法是討論基因表達常用的方法，可推臬出癌基因的表達程度。

差異雜交（differentialhybridization）

是將基因組文庫的重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用兩種混合的不同cDNA探針（如：轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌組織的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA）分別與濾膜上的DNA雜交，分析兩張濾膜上對應(yīng)位置雜交信息以分別差異表達的基因。適用于基因組不太簡單的真核生物（如酵母）表達基因的比較，假陽性率較低。但對基因組特別簡單的鹽酸核生物（如人），則因工作量太大，表達的序列所占百分比較低（僅5％左右），價值不大。

cDNA微點隈雜交（cDNAmicroarrayhybridization）

是指將cDNA克隆或cDNA的PCR產(chǎn)物以高度的列陣形式排布并結(jié)合于固相支持物上（如：尼龍膜或活化的載玻片）以微點陣，然后用混合的不同DNA探針與微點陣上的DNA進行雜交。再利用熒光、化學(xué)發(fā)光、共聚焦顯微鏡等技術(shù)掃描微點陣上的雜交信息。它比差異雜交技術(shù)的效率高、速度快、成本低，適用于大規(guī)模的分析。已成商品問世。其缺點是無法克服保守的同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾。

寡核苷酸微點隈雜交（oligonucleotidemicroarrayhybridization）

是在特別的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共價結(jié)合于支持物表面，與平均長度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針進行雜交，以提高雜交的特異性和靈敏度。應(yīng)用共聚焦顯微鏡可檢測跨越三個數(shù)量級的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測，以區(qū)分基因家族不同成員的差異表達特征，或鑒定同一轉(zhuǎn)錄在不同組織和細胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點。

液相雜交（solutionhbridization）

指使變性的待測核酸單鏈與放射笥核素標(biāo)記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開，然后結(jié)膈后在雜妝分子中的探針量，就可推算出被測的核酸量。

遞減雜交（subtractivehybridizatio）

是利用兩種來源全都而功能不同的組織細胞提取mRNA（或逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA）,在肯定的條件下以過量的驅(qū)動mRNA或cDNA與測試的單鏈cDNA或mRNA進行液相雜交，通過羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分，保留特異表達的目的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫，可獲得特異表達的目的基因cDNA全長序列。

核酸原位雜交

用特定標(biāo)記的已知挨次核酸作為探針與細胞級或組織切片中核酸進行復(fù)性雜交并對其實行檢測的方法，稱為核酸原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）。用來檢測DNA在細胞核或染色休上的分布，與細胞內(nèi)RNA進行雜交以討論該組織細胞中特定基因表達水閏；還用于細胞、組織中有無特異性菌、病毒檢測的討論。

該法的優(yōu)點是特異性高，可精確定位；能在成分簡單的組織中進行單一細胞的討論而不受同一組織中其他成分的影響；不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性；并可完整地保持組織與細胞的形態(tài)。因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)同學(xué)物學(xué)的討論，如基因定位、基因制失，基因易位、特異基因整合部物色檢測等討論。近年來由定性進展到定量，方法更為完善。

DNA分子克隆技術(shù)（也稱基因克隆技術(shù)）

在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括：制備目的基因?qū)⒛康幕蚺c載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組導(dǎo)入宿主細胞篩選、鑒定擴增和表達。載體（vecors）在細胞內(nèi)自我復(fù)制，并帶動重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深化分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫，一種是基因組文庫（genomiclibrary）,另一種是cDNA庫。

核酸序列測定

DNA的堿基序列打算著基因的特性，DNA序列分析（測序，sequencing）是分子生物學(xué)重要的基本技術(shù)。無論從基因庫中篩選的癌基因或經(jīng)PCR法擴增的基因，最終均需進行核酸序列分析，可藉以了解基因的精細結(jié)構(gòu)，獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜，分析基因的突變及對功能的影響，關(guān)心人工俁成基因、設(shè)計引物，以及討論腫瘤的分子發(fā)病機制等。測序是在高辨別率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化學(xué)降解少和Sanger的雙脫氧法等，近年來已有DNA序列自動測定儀問世?；瘜W(xué)降解法是在DNA的片段的5`端標(biāo)記核素，然后用專一性化學(xué)試劑將DNA特異地降解，在電泳和自顯影后，可得到從標(biāo)記端延長的片段供測讀序列和進行比較。一般能讀出200-250個核苷酸序列。雙脫氧法是采納核苷酸鏈終止劑，如：2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長，與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進行反應(yīng)，這樣可得到一組結(jié)尾長衙不一、不同專一性核苷酸鏈終止劑結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分別和放射自顯影，可讀出合成的DNA核苷酸序列，依據(jù)堿基互補原則，可推算出模板DNA分子的序列。

化學(xué)降解法只需一化學(xué)試劑，重復(fù)性好，簡單把握；而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質(zhì)量的DNA聚合酶，便隨著M13噬菌體載體的創(chuàng)造和運用，合成的引物簡單獲得，測序技術(shù)不斷改進，故此法已被廣泛應(yīng)用?；撗醴ǖ淖詣蛹す鉄晒鉁y序儀，使測工作更快速和簡便，而且保證高度重復(fù)性。至于RNA測序現(xiàn)大多采納將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后同測序，然后反推RNA序列

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡稱PCR技術(shù)，是一種利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進行特定的DNA片斷高效擴增的技術(shù)，可檢出微量靶序列（甚至少到1個拷貝）。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依靠于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。僅需用極少量模板，在一對引物介導(dǎo)下，在數(shù)小時內(nèi)可擴增至