鋅預處理對c-fos表達和動物行為學的影響,病理學論文

鋅預處理對c-fos表達和動物行為學的影響,病理學論文神經病理性疼痛(neuropathypain,NPP)是由于感染、腫瘤和外傷等原因導致中樞或外周神經系[1,2]統損傷后所引起的一種慢性疼痛狀態(tài).由于其發(fā)病機制極其復雜,而且鎮(zhèn)痛藥物的治療效果較差,因而,NPP已經成為嚴重影響患者生存質量的臨床頑癥之一,而研制更為有效的治療手段也成為學者[3]們的研究熱門.近年來的研究發(fā)現,微量元素鋅似[4]乎與NPP密切相關.因而,為了深切進入研究鋅對NPP的影響,本文將c-fos蛋白和動物行為學作為觀察對象,利用原子吸收光譜技術、動物行為學檢測、免疫組化和圖像分析技術檢測鋅預處理對c-fos表示出和動物行為學的影響,進而為揭示鋅影響NPP的機制提供理論根據.1材料與方式方法1.1主要試劑與儀器兔抗小鼠多克隆c-fos抗體(cellsignaling公司);免疫組織化學染色試劑盒和DAB染色劑(福州邁新公司);辣椒素(Santa公司);光學顯微鏡、原子吸收光譜儀、vonFrey刺激針和計算機圖像分析系統等.1.2動物分組與模型制備48只C57/BL6小鼠,8周齡大,雌雄各24只,體重20~30g(北京維通利華實驗動物中心提供).將小鼠隨機分4組:采用右后足底注射辣椒素(0.5%,5l)制備NPP模型.①對照組(Con):給予適鋅飼料(鋅30mg/kg/d)喂養(yǎng)2周后,右側后足底注射溶劑(吐溫80、酒精和生理鹽水混合液);②適鋅喂養(yǎng)組(N-NPP):給予適鋅飼料(鋅30mg/kg/d)喂養(yǎng)2周后足底注射辣椒素;③低鋅喂養(yǎng)組(L-NPP):給予低鋅飼料(鋅0.85mg/kg/d)喂養(yǎng)2周后注射辣椒素;④高鋅喂養(yǎng)組(H-NPP)給予硫酸鋅水溶液(227mg/L/d)喂養(yǎng)2周后注射辣椒素.1.3取材與標本制備、動物自主行為學觀察注射辣椒素后第7天,將小鼠用4%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉后,取腰5節(jié)段的脊髓,一部分稱重后,-80℃保存,用于原子吸收光譜技術檢測;另一部分放入4%多聚甲醛溶液固定12h,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,制備5m厚的石蠟切片,用于免疫組織化學染色.從注射辣椒素前2天開場,天天觀察小鼠的行為學變化,觀察有無跛行、注射側后足不敢著地負重、舔足、咬足、足部畸形、自噬、離地時間延長等現象,一直觀察到注射辣椒素后第7天.1.4機械痛閾檢測、原子吸收光譜技術注射辣椒素前2天和注射后第7天,將小鼠放在圍有透明玻璃的金屬網眼平臺上,等動物適應環(huán)境后,用vonFrey刺沖動物右后足底.動物出現縮足和快速甩足等動作時以為是有反響;刺激針彎成90度而動物沒有抬足等反響則以為是無反響.10次當中出現5次以上的縮足反響者視作陽性,機械性痛閾[5](g)就是能引起縮足反響的最小力度.足底注射辣椒素后第7天,取血清和脊髓組織.血清參加三氯醋酸,3000r/min離心5min,取上清;脊髓組織經混合酸浸泡過夜后消化,利用原子吸收光譜分析法測定鋅含量.1.5免疫組織化學染色、圖像分析石蠟切片常規(guī)脫蠟入水,用微波進行修復.經3%HO孵育10min,以封閉內源性過氧化物酶;0.01M22PBS沖洗,5min3次;用正常非免疫動物血清孵育10min;甩掉血清,參加兔抗小鼠多克隆c-fos抗體(1:200),在4℃下孵育過夜;0.01MPBS沖洗,5min3次;參加山羊抗兔IgG(1:200),室溫下孵育10min;0.01MPBS沖洗,5min3次;參加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶孵育10min;0.01MPBS沖洗,5min3次;用DAB顯色5min,入水中止反響.切片常規(guī)脫水、透明和封片,光鏡下進行觀察.用正常非免疫動物血清代替一抗作為陰性對照.用Image-ProPlus6.0圖像分析系統對免疫組化結果進行圖像分析.每個樣本選取5張切片,每張切片于400倍光鏡下系統隨機選取3個視野進行檢測,計算平均光密度值(averageoptical,AO).統計學分析應用SPSS19.0軟件進行統計處理,實驗數據用均數標準差表示,采用單因素方差分析(ANOVA)方式方法進行數據分析,P0.05為差異有統計學意義.2結果2.1原子吸收光譜檢測結果在注射辣椒素后7d,正常喂養(yǎng)組動物血清鋅和脊髓中的鋅含量均顯著減少(P0.01).低鋅喂養(yǎng)組動物血清鋅和脊髓鋅的含量更低;而高鋅喂養(yǎng)組動物的血清鋅和脊髓鋅含量最高P0.01,圖12).2.2小鼠行為學變化足底注射辣椒素后第1天小鼠即出現注射側后足跛行、不敢負重、經常將后足縮至腹部或拖著后足行走,傷側腳趾外翻并攏,經常舔足或甩足,活動度減少,明顯不如注射之前活潑踴躍,這種行為一直持續(xù)到觀察期末.華而不實,低鋅喂養(yǎng)組(L-NPP)小鼠行為學改變最為嚴重,而高鋅喂養(yǎng)組(H-NPP)小鼠的行為學改變最輕.機械痛閾檢測顯示:各組動物注射辣椒素后7天的機械痛閾顯著降低,痛敏加強(P0.01).華而不實,L-NPP組的機械痛閾最低,而H-NPP組的痛閾最高(P0.01,圖3).2.3免疫組化染色結果c-fos免疫組織化學陽性產物呈棕褐色顆粒狀,主要表示出在脊髓神經元的細胞核上.對照組動物在脊髓后角淺層有少量的陽性表示出產物,陽性細胞較少.與對照組相比,其它三組NPP動物的c-fos陽性表示出均增加,陽性細胞密集,平均光密度(AO)值增高(P0.01).華而不實,L-NPP組的陽性顆粒和陽性細胞最密集,AO值最高;H-NPP組的陽性顆粒和陽性細胞最稀疏,AO值最低(P0.01,圖4,5).3討論神經病理性疼痛是由神經系統受損傷所引發(fā)的一種慢性疾病,其發(fā)病原因多樣,包括:糖尿病等代謝系統疾病所引發(fā)的神經痛、腫瘤侵襲等引發(fā)的神經痛、腦和脊髓外傷等引起的中樞神經系統損傷、[6-7]病毒感染和放化療所引發(fā)的神經痛并發(fā)癥等.患者的主要臨床病理生理學表現是:痛覺過敏、痛覺超敏、自發(fā)性疼痛和異位痛等.近年來,由于社會老齡化日益嚴重,而且癌癥等疾病的生存率逐年提[8]高,導致NPP的發(fā)病率顯著增加,高達1%左右.由于這種疼痛劇烈而持久,可持續(xù)數周、數月甚至數年,臨床上缺乏有效的治療方式方法,藥物治療往往還伴隨著成癮性等問題,因而,NPP已經成為學者們密切關注的一大頑癥,而深切進入討論NPP的發(fā)病機制,尋找有效的治療靶點勢在必行.研究發(fā)現,鋅是機體的一種重要的微量元素,[9]其廣泛分布于機體的各種組織和器官,在中樞和外周神經系統中的分布尤其豐富,華而不實,游離狀態(tài)的[10]鋅在神經傳導活動中發(fā)揮著極其重要的調控作用.[4]Nozaki等發(fā)現,鋅是病理性疼痛的一種內源性的抑制劑,能抑制在興奮性傳導經過中起重要作用的NMDA受體,其與病理性疼痛的構成與傳導密切相[11]關.有報道稱,神經損傷后,脊髓后角淺層的鋅離子顯著減少,伴隨動物的機械性痛閾降低,動物出現痛覺過敏現象,提示鋅可能介入了痛覺的產生與傳導.另有研究發(fā)現,鋅能抑制對NPP的產生具[12]有促進作用的P物質在脊髓的表示出;除此之外,鋅也能使痛閾升高,降低痛敏,提示鋅可能對病理性疼痛[13]具有抑制作用.本研究結果與之前的研究相符,我們利用原子吸收光譜技術和動物行為學觀察發(fā)現,NPP后,動物血清和脊髓中的鋅含量顯著減少,動物的機械痛閾降低,痛敏加強.高鋅喂養(yǎng)能改善血清和脊髓中的缺鋅狀態(tài),提高機械痛閾值,減輕痛敏;而低鋅喂養(yǎng)則加重血清和脊髓中的缺鋅狀態(tài),降低機械痛閾值,促進痛覺過敏,提示,鋅對病理性疼痛具有抑制作用.那么鋅是怎樣抑制病理性疼痛的呢?研究發(fā)現,原癌基因c-fos作為一種即刻早期基因,它能被第二信使誘導,介入細胞內信息傳遞經過,在NPP時的表示出顯著增加,是神經元激活的標志,也[14]是痛覺過敏狀態(tài)發(fā)展的反映.研究發(fā)現,在甲醛引起的炎性痛模型中,c-fos蛋白在脊髓表示出上調,[15]熱痛閾降低;鞘內給予c-fos反義寡核苷酸探針能顯著抑制福爾馬林和腰5脊神經結扎誘導的大鼠腰髓背角c-fos陽性神經元的增加,提示c-fos的活化對于病理性疼痛的發(fā)展有顯著意義,而抑制其活化能緩[16]解慢性疼痛.本研究中,我們發(fā)現,對照組動物在脊髓后角淺層c-fos只要少量陽性表示出,陽性細胞較少.注射辣椒素后,脊髓后角c-fos陽性表示出顯著增加,陽性細胞密集,AO值增高.高鋅喂養(yǎng)能使c-fos的表示出顯著下調,AO值降低;而低鋅喂養(yǎng)能使c-fos的表示出更多,AO值增高,我們揣測鋅可能通過降低脊髓后角原癌基因c-fos的表示出進而抑制了病理性疼痛的產生與傳導,進而使動物的機械痛閾顯著增高,痛敏降低.盡管我們的研究結果為研究鋅介入NPP的機制提供了一定的理論數據,但是,鋅是通過如何的機制來抑制c-fos的表示出?鋅能否還通過其它的機制介入NPP的傳導?這些都有待于我們更深切進入的研究.【以下為參考文獻】[1]SantoroD,SattaE,MessinaS,etal.Paininend-stagerenaldisease:afrequentandneglectedclinicalproblem[J].ClinNephrol,2020,79(1):S2-11.[2]JeongNY,ShinYH,JungJ.Neuropathicpaininhereditaryperipheralneuropathy[J].JExercRehabit,2020,9(4):397-399.[3]HussainAM,KhanMA.Painmanagementaftertraumaticspinalcordinjury[J].JCollPhysiciansSurgPak,2020,22(4):246-247.[4]NozakiC,VerqnanoAM,FilliolD,etal.Zincalleviatespainthroughhigh-affinitybindingtotheNMDAreceptorNR2Asubunit[J].NatNeurosci,2018,14(8):1017-1022.[5]ChaplanSR,BaehFW,PogrelJW,etal.Quantitativeassessmentoftactileallodyniaintheratpaw[J].JNeurosciMethods,1994,53(1):55-63.[6]GibsonCA.Reviewofposttraumaticstressdisorderandchronicpain:thepathtointegratedcare[J].JRehabilResDev,2020,49(5):753-776.[7]OffnerKA,LoopT.Pathophysiologyandepidemiologyofpaininthoracicsurgery[J].AnasthesiolIntensivmedNotfallmedSchmerzther,2020,47(9):568-575.[8]PethoG,ReehPW.Sensoryandsignalingmechanismsofbradykinin,eicosanoids,platelet-activatingfactorandnitricoxideinperipheralnociceptors[J].PhysiolRev,2020,92(4):1699-1775.[9]張莉,郭敏,張萍,等.鋅轉運體-1在小鼠腎臟的表示出[J].解剖科學進展,2018,16(6):547-549.[10]ZhangL,ChiZH,Ren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