實(shí)驗(yàn)擴(kuò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa

一、目的與要求以牛血清雙向擴(kuò)散試驗(yàn)為例，掌握雙向雙擴(kuò)散試驗(yàn)的原理、操作方法及結(jié)果的判定。實(shí)驗(yàn)六瓊脂免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)原理將可溶性抗原和抗體分別加到瓊脂板相對(duì)應(yīng)的的孔中，兩者各自向四周擴(kuò)散，經(jīng)一定時(shí)間后，若二者有特異性，就在比例合適處形成白色沉淀線。根據(jù)沉淀線的位置、數(shù)量、形狀以及對(duì)比各沉淀線之間的關(guān)系，可對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性分析和純度鑒定。

可溶性抗原＋相應(yīng)抗體

白色沉淀已知抗原（牛血清）、已知陽性血清（兔抗牛血清）、待檢血清、1%的瓊脂糖（用生理鹽水配制）、陰性對(duì)照血清。平皿或載玻片、酒精燈、濕盒、打孔器（直徑3mm）、37℃恒溫箱、移液器或可調(diào)微量加樣器等。

三、實(shí)驗(yàn)材料四、操作方法制板：用注射器吸取3.5ml左右加熱溶化的1.0～1.2%瓊脂糖澆注于一潔凈的載玻片上，厚度3.0mm左右；或者倒6-10ml溶化的瓊脂糖于平皿（直徑6.5cm）中注意勿產(chǎn)生氣泡。打孔：待瓊脂板凝固后，將按實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)的圖形置瓊脂板下，用打孔器打孔，一般孔徑3-5mm，孔間距3-5mm（孔徑和孔間距依不同疫病檢疫規(guī)程而定），根據(jù)需要，可打成梅花孔（如下圖所示，中央1孔，周圍6孔），用針尖頭挑出孔內(nèi)瓊脂。封底：將瓊脂板無凝膠面在酒精燈火焰上輕輕灼燒

，用手背感覺微燙即可(底部瓊脂剛剛?cè)芑?，封閉孔的底部，以防側(cè)漏。加樣：每孔10ul左右，中央孔加已知抗原（小牛血清）、外周孔分別陽性血清（兔抗牛血清），加待檢血清、陰性對(duì)照血清。擴(kuò)散：加樣完畢后，將瓊脂板放濕盒中，保持一定的濕度，置37℃溫箱中放置24小時(shí)后觀察結(jié)果。

注意事項(xiàng)：制板時(shí)，玻片要清潔，邊緣要整齊，載玻片必須保持水平位置要避免產(chǎn)生氣泡。打孔時(shí)注意避免產(chǎn)生裂縫或?qū)傊c玻片脫離。加樣一定要準(zhǔn)確，并且不同逸出孔外，否則結(jié)果不好觀察。五、結(jié)果判定1、若凝膠中抗原、抗體是特異性的，則形成抗原抗體復(fù)合物，在兩孔之間出現(xiàn)清晰致密白色的沉淀線，為陽性反應(yīng)。若在72h仍未出現(xiàn)沉淀線則為陰性反應(yīng)。2、抗體效價(jià)測(cè)定：以出現(xiàn)沉淀帶的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清的瓊擴(kuò)效價(jià)。五、結(jié)果判定1．用以檢測(cè)抗原或比較抗原差異時(shí)，將抗血清置中心孔，將待測(cè)抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰孔。若出現(xiàn)沉淀帶完全融合，證明為同種抗原；若二者有部分相連，形成的沉淀線相切兩孔中抗原部分相同；若二條沉淀線相互交叉，說明二者抗原完全不同。

抗原特異性與沉淀線形狀的關(guān)系實(shí)驗(yàn)六酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(ELISA)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/p>

以檢測(cè)豬O型口蹄疫病毒抗體為例，掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、操作方法及結(jié)果的判定。二、實(shí)驗(yàn)原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是應(yīng)用酶標(biāo)記的抗體（或抗原）在固相支持物表面檢測(cè)未知抗原（或抗體）的方法。酶與抗體（或抗原）交聯(lián)后，再與集合結(jié)合在固相支持物表面的相應(yīng)抗原或抗體反應(yīng)，形成酶標(biāo)記抗體-抗原復(fù)合物，此時(shí)加入酶底物和顯色劑，在酶催化底物液體后呈現(xiàn)顯色反應(yīng)，液體顯色的強(qiáng)弱和酶標(biāo)記抗體-抗原復(fù)合物的量成正比，借此反映出待檢測(cè)的抗原或抗體量。

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。三、實(shí)驗(yàn)材料1.辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗豬IgG抗體(山羊抗豬IgG)；2.滅活豬O型口蹄疫病毒抗原、豬O型口蹄疫病毒陽性血清和正常豬血清；3.待檢豬血清；4.包被緩沖液，即0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液；5.洗滌緩沖液，即pH7.4PBST；6.稀釋液，即0.1g牛血清白蛋白（BSA）加洗滌緩沖液（PBST）；7.底物緩沖液，即pH5.0磷酸鹽-檸檬酸；8.TMB（四甲基聯(lián)苯胺）溶液；9.終止液，即2mol/LH2SO4；10.96孔酶標(biāo)反應(yīng)板、ELISA檢測(cè)儀、微量移液器、槍頭、37℃溫箱等。四、操作方法稀釋液（空白）100ul陽性血清100ul陽性血清100ul陰性血清100ul陰性血清100ul待檢血清100ul待檢血清100ul待檢血清100ul

1.加樣：加血清每孔加100微升，37℃溫育30min。

2.洗滌：倒盡板孔中血清液體并甩干，加200微升洗滌液，靜放3min，將洗滌液倒掉甩干，將反應(yīng)板倒置在吸水紙上拍干，反復(fù)洗滌三次。

3.加酶標(biāo)抗體：加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗豬IgG,每孔100微升，放置37℃，溫育30min。

4.洗滌同2。

5.加底物：鄰苯二胺溶液（TMB）加100ul，室溫暗處5-10分鐘6.加終止液：每孔50微升。

五.觀察判定：結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果,反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。酶標(biāo)檢測(cè)儀上，于650nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值。以P/N比值表示：待檢樣品的OD值與