血紅蛋白的提取選修一

課題三血紅蛋白的提取和分離

1.知道凝膠色譜法、電泳法等分離生物大分子技術(shù)的基本原理。2.掌握血紅蛋白提取和分離的基本過程。（預(yù)習(xí)教材15分鐘）

學(xué)習(xí)目標(biāo)思考1分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。思考2蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。1．凝膠色譜法

(1)概念也稱做

，是根據(jù)

分離蛋白質(zhì)的有效方法。分配色譜法相對(duì)分子質(zhì)量的大小凝膠是什么？(2)原理

由

構(gòu)成的凝膠，內(nèi)部有許多貫穿的

。多孔球體通道1．凝膠色譜法

當(dāng)

不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量

的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程

，移動(dòng)速度

。而相對(duì)分子質(zhì)量

的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在

移動(dòng)，路程

，移動(dòng)速度

，從而使相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子得以

。相對(duì)分子質(zhì)量較小較長較慢較大凝膠外部較短較快分離【例】

下圖中，可表示為相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的移動(dòng)過程的是 ()B【鞏固】凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理依據(jù)是 ()A．根據(jù)蛋白質(zhì)分子與凝膠的親和力的大小B．根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小C．根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的多少D．根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的大小B2.緩沖溶液1、作用：能夠抵制（）對(duì)溶液的（）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值

在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖液是（），目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的（），保證血紅蛋白的正常（），便于觀察紅色和材料的科學(xué)研究活性。磷酸緩沖液PH環(huán)境結(jié)構(gòu)和功能2.緩沖溶液(1)概念指

在電場(chǎng)的作用下發(fā)生

的過程。(2)原理在一定的

下，多肽、核酸等生物大分子的可解離基團(tuán)會(huì)帶上

或

，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著

的電極移動(dòng)。帶電粒子遷移pH正電負(fù)電與其所帶電荷相反3．

電泳(3)作用電泳利用了待分離樣品中各種分子

的差異及分子本身的

、

的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的

，從而實(shí)現(xiàn)樣品中

。(4)方法常用的電泳方法有

和

。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用

。帶電性質(zhì)大小形狀遷移速度各種分子的分離瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳3．

電泳使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異[思維激活]

凝膠色譜法和電泳法在實(shí)現(xiàn)分子分離的原理方面有何不同？提示凝膠色譜法分離分子是依據(jù)分子質(zhì)量大小，利用凝膠色譜柱使大分子優(yōu)先洗脫出來，而小分子后分離出來。電泳法分離分子則是依據(jù)各種分子帶電性質(zhì)的差異，以及分子本身的大小，形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)在電場(chǎng)中將各種分子分離。洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。血紅蛋白提取和分離的實(shí)驗(yàn)操作

實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉1．蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：

、

、

和

。A樣品處理及粗分離(1)紅細(xì)胞的洗滌采集血樣，

，吸取血漿后加

，再低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色。目的是除去雜質(zhì)，以利于后續(xù)步驟的分離純化。血紅蛋白提取和分離的實(shí)驗(yàn)操作

樣品處理粗分離純化純度鑒定低速短時(shí)間離心生理鹽水(2)血紅蛋白的釋放將洗滌好的紅細(xì)胞依次加入

至原血液體積、40%體積的

，置于磁力攪拌器上攪拌10min，使紅細(xì)胞吸水

，血紅蛋白釋放出來。(3)分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到

中，以2000r/min的速度

10min。使血紅蛋白和其他雜質(zhì)分離開，便于下一步對(duì)血紅蛋白的純化。蒸餾水甲苯漲破離心管離心血紅蛋白提取和分離的實(shí)驗(yàn)操作

分離血紅蛋白溶液有機(jī)溶劑（無色透明的甲苯層）脂類物質(zhì)（白色脂溶性物質(zhì)沉淀層）血紅蛋白溶液（紅色透明液體）紅細(xì)胞破碎物沉淀（暗紅色沉淀物）（4）透析(粗分離)a過程：b目的：c原理：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)；用于更換樣品的緩沖液。透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。B凝膠色譜操作(1)凝膠色譜柱的制作：準(zhǔn)備材料→加工橡皮塞→安裝

。(2)凝膠色譜柱的裝填。(3)樣品的

。色譜柱加入和洗脫血紅蛋白提取和分離的實(shí)驗(yàn)操作

（2）凝膠色譜柱的裝填材料：

凝膠的前處理：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。（2）凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。（2）凝膠色譜柱的裝填50cm高注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。（3）樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說明色譜柱制作成功）。（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。樣品的加入和洗脫的操作不正確的是A．加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B．加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C．等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D．用吸管小心的將1ml透