酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定123

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,

ELISA

）

抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)與影響因素反應(yīng)條件：

自身因素:環(huán)境因素:適宜溫度電解質(zhì)酸堿度特點(diǎn)：

特異性可逆性最適比例CompanyLogo凝集反應(yīng)(agglutination):顆粒性抗原與抗體的反應(yīng)。沉淀反應(yīng)(precipitation):可溶性抗原與抗體的反應(yīng)。補(bǔ)體參與的反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabellingtechnique）:用示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)。

抗原-抗體反應(yīng)的基本檢測(cè)方法CompanyLogo用示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，使其與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng)，使微量的、不可見(jiàn)的反應(yīng)成為可見(jiàn)的或可測(cè)定的。CompanyLogo用FITC-抗IgM單抗計(jì)數(shù)B細(xì)胞免疫熒光技術(shù)CompanyLogo課程內(nèi)容ELISA的原理ELISA的分類(lèi)間接ELISA的具體操作ELISA在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用實(shí)例CompanyLogoELISA的原理

1.抗原抗體反應(yīng)的特異性2.抗原或抗體的固相化3.抗原或抗體的酶標(biāo)記ECompanyLogo間接ELISA實(shí)驗(yàn)?zāi)康模盒∈驣gG免疫兔，檢測(cè)兔血清中抗小鼠IgG抗體的效價(jià)實(shí)驗(yàn)材料：包被抗原：小鼠血清待檢抗體/一抗：兔抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體/二抗：HRP-驢抗兔IgG聚苯乙烯酶標(biāo)板水浴箱

移液器槍頭包被液：pH9.6的碳酸鹽緩沖液

封閉液/

封：5%脫脂奶粉(ALB)稀釋液/?。簆H7.40.05M的PBS（磷酸鹽緩沖液）

洗液：PBST（PBS+0.05%吐溫20）

顯色液：四甲替聯(lián)苯胺(TMB)

終止液/終：2M硫酸陽(yáng)性反應(yīng)的最大稀釋度為待測(cè)樣品的效價(jià)。鼠IgG(抗原)兔抗小鼠IgG(一抗)HRP-驢抗兔IgG(二抗)免疫兔免疫驢CompanyLogo操作步驟包被：1：2000稀釋的正常小鼠血清，4℃過(guò)夜封閉：5%脫脂奶粉，37℃，20min加待檢抗體：倍比稀釋兔抗鼠IgG抗血清，37℃15min加酶標(biāo)抗體：1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的驢抗兔IgG抗血清(已稀釋好)，37℃15min加底物液顯色→→→→洗滌：3次，1min/次洗滌：3次，1min/次洗滌：3次，1min/次→終止液終止顯色（黃）空白對(duì)照無(wú)顯色待測(cè)樣品顯色明顯(藍(lán))EEEE底物液底物、終止液加50ul／孔封一抗二抗無(wú)色避光從此步開(kāi)始本次實(shí)驗(yàn)！CompanyLogo倍比稀釋法與加樣除第一列孔外，先在其余每孔加100ul稀釋液(稀)；在第一列孔加入200ul一抗；取100ul加入第二列孔，混勻從第二列孔取100ul液體至第三列孔；。。。。。。AB123456789101112blank

每孔終體積為100ul,上下兩排一致一抗1:5001:1000…….1:2000100μL100μL100μLCompanyLogoELISA的分類(lèi)（一）直接法（二）間接法（三）雙抗體夾心法（四）競(jìng)爭(zhēng)法CompanyLogo（一）直接法CompanyLogo間接法的原理為利用酶標(biāo)記的二抗以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢一抗，故稱(chēng)為間接法。其優(yōu)點(diǎn)在于只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)二抗建立檢測(cè)相應(yīng)一抗的方法。可用于傳染病的診斷。（二）間接法（測(cè)抗體）酶標(biāo)二抗一抗AgwashBSAwashwashTMB血清CompanyLogo（三）雙抗體夾心法（測(cè)抗原）只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶標(biāo)Ab而建立此法。此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。包被Ab酶標(biāo)AbAgTMBwashwashwash血清CompanyLogo（四）競(jìng)爭(zhēng)法（HBcAb

）

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體；如HBeAb，HBcAb；

小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。

washTMBHBcAg酶標(biāo)HBcAbwashHBcAb血清CompanyLogo病原微生物及其抗體檢測(cè)如:肝炎病毒,SARS等

臨床疾病診斷中的應(yīng)用蛋白質(zhì)測(cè)定:各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)記物ELISA在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用CompanyLogoTMB+H2O2聯(lián)苯醌

+2H2O酶催化底物液顯色ECompanyLogo結(jié)果的判定肉眼判定結(jié)果：于白色背景上直接肉眼觀(guān)察。顏色越深，反應(yīng)越強(qiáng)；陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺。而樣品顯色明顯且逐漸變淺，根據(jù)顏色的深淺，以“＋”、“－”表示。測(cè)定A值：在酶標(biāo)儀上，根據(jù)不同底物設(shè)定波長(zhǎng)（TMB底物為450n