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谷氨酰胺的發(fā)酵控制
WEIBO.COM/JDPPT發(fā)酵條件控制代謝途徑調(diào)控412右圖是谷氨酰胺發(fā)酵工藝圖L-谷氨酰胺是在谷氨酸發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上,在谷氨酰胺合成酶作用下生產(chǎn)L-谷氨酰胺。谷氨酰胺采用谷氨酸生產(chǎn)菌,可以實(shí)現(xiàn)谷氨酸發(fā)酵轉(zhuǎn)向谷氨酰胺發(fā)酵。發(fā)酵轉(zhuǎn)換的條件是:一、發(fā)酵培養(yǎng)基中有高濃度的銨鹽存在,其含氮量比谷氮酸發(fā)酵時(shí)所用的氮量多得多,在谷氨酰胺合成酶的催化下,由谷氨酸進(jìn)一步合成為谷氨酸胺;二、菌體增殖進(jìn)入平衡期后,發(fā)酵pH值必須調(diào)整到6.0左右,以抑制谷氨酰胺酶的活力,避免谷氨酰胺被分解成谷氨酸。谷氨酰胺合成機(jī)理發(fā)酵條件的變更,谷氨酸產(chǎn)生菌中的谷氨酰胺合成酶活力增加,而谷氨酸合酶活力受到抑制Textinhere谷氨酸谷氨酰胺積累谷氨酰胺由于細(xì)胞環(huán)境的影響,谷氨酰胺易從細(xì)胞中分泌出來(lái)積累在發(fā)酵液中,而谷氨酸滲透性減小(滯留在細(xì)胞內(nèi))1發(fā)酵條件控制L-谷氨酰胺生物合成是在谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)催化下進(jìn)行的,所以發(fā)酵法生產(chǎn)L-Gln的關(guān)鍵在于調(diào)控GS酶活性。NH4+濃度谷氨酸脫氫酶谷氨酰胺合成酶谷氨酸合酶GOGATTesch在谷氨酸棒桿菌(CorynebaCteriumglutamicum)中研究了NH4+濃度對(duì)GDH、GS、GOGAT活性的影響,結(jié)果如下:NH4+濃度增加時(shí),GDH活性基本沒(méi)有發(fā)生變化;NH4+濃度大于10mmol/L時(shí),GS、GoGAT活性小于1mmol/L的10%,即分別低于110U/mg蛋白、42U/mg蛋白;發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫氫酶酶促反應(yīng)是谷氨酸棒桿菌攝取NH4+的第一步反應(yīng)。此研究結(jié)果為梯度補(bǔ)氮生產(chǎn)L-Gln提供了理論基礎(chǔ)。GS的表達(dá)易受到高濃度銨鹽的阻遏,氮源的一次性補(bǔ)加也容易導(dǎo)致谷氨酰胺合成酶活性急劇下降;在銨鹽不足時(shí),GS表達(dá)量就會(huì)增加,所以氮饑餓處理可以提高中GS的表達(dá)量,梯度補(bǔ)加氮源也可以盡量減少GS活力的快速喪失。1.1氮源氮饑餓處理李春等為了解決高濃度銨鹽阻遏谷氨酰胺合成酶表達(dá)與谷氨酰胺合成需要過(guò)量銨之間的矛盾,提出了原位氮饑餓與銨鹽梯度補(bǔ)加協(xié)同調(diào)控策略,提高了谷氨酰胺的產(chǎn)量,最高可達(dá)2.19%,比原位氮饑餓工藝提高了近72%,比未經(jīng)過(guò)氮饑餓處理的舊工藝提高了近200%。陳奎發(fā)等設(shè)計(jì)了在線氮饑餓處理的發(fā)酵過(guò)程;在限制初始氮源濃度的條件下,菌體在生長(zhǎng)后期自然進(jìn)入氮饑餓狀態(tài),GS酶表達(dá)量增加,此后再提供充足的銨鹽,提高L-Gln的合成能力,結(jié)果使L-Gln的產(chǎn)量提高了69%,達(dá)到11.5g/L,菌體內(nèi)谷氨酰胺合成酶活性提高了2倍以上。1.2金屬離子為了提高谷氨酰胺的產(chǎn)量,金屬離子特別是Zn2+、Mg2+和Mn2+的供給是必要的。Zn2+對(duì)谷氨酰胺合成酶具有刺激作用,同時(shí)Zn2+還可增強(qiáng)NH4Cl對(duì)谷氨酰胺酶的抑制作用,使其不能分解谷氨酰胺。1.3pH對(duì)谷氨酰胺發(fā)酵的影響pH主要影響酶的活性和菌的代謝
在中性和微堿性條件下(PH7.0-8.0)積累谷氨酸,在酸性條件下積累谷氨酰胺發(fā)酵前期應(yīng)控制pH值在偏堿性環(huán)境,以促進(jìn)菌體生長(zhǎng),并激活谷氨酸合成酶的活性,保證谷氨酰胺合成前體谷氨酸的合成;發(fā)酵后期應(yīng)控制pH值在偏酸性環(huán)境,以增加谷氨酰胺合成酶的活性,同時(shí)抑制谷氨酰胺酶的活性,使谷氨酰胺大量積累生成,而減少谷氨酸的生成量。1.4供氧對(duì)谷氨酰胺發(fā)酵的影響氨基酸發(fā)酵過(guò)程中,供氧不足會(huì)積累乳酸等副產(chǎn)物,菌體減少。通過(guò)通氣攪拌增加溶氧量。生產(chǎn)谷氨酰胺條件影響細(xì)胞膜通透性二代謝途徑調(diào)控天津短桿菌株合成谷氨酰胺的主流代謝中,有幾個(gè)關(guān)鍵酶控制其強(qiáng)度,這幾個(gè)酶分別受不同代謝物的反饋調(diào)節(jié),活化這些酶有利于L-GLn的生物合成。(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,它受天冬氨酸的反饋抑制;(2)丙酮酸激酶,它是一個(gè)別構(gòu)酶,受乙酰CoA、丙氨酸、ATP的反饋抑制;(3)丙酮酸脫氫酶系,該酶是催化不可逆反應(yīng)的酶,受乙酰CoA、NADH、GTP的反饋抑制;(4)異檸檬酸脫氫酶,ADP和NADH抑制此酶的活性;(5)Glu脫氫酶和(6)GLn合成酶,此二酶是保證α-酮戊二酸向GLu而不是向草酰乙酸的三羧酸循環(huán)方向的關(guān)鍵。同時(shí)在此循環(huán)中還存在著向天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸的分枝代謝,我們?cè)O(shè)法減弱分枝代謝而強(qiáng)化主流代謝,主要的方法是減弱催化這些分枝代謝的酶。
生物合成途徑中關(guān)鍵酶的調(diào)控陳國(guó)強(qiáng)等人重組了一株含有透顫菌血紅蛋白基因vgb和谷氨酰胺合成酶突變基因glnA’的野生谷氨酸棒桿菌C.glutamicumATCC14067,可以實(shí)現(xiàn)在較低溶氧量水平,較低成本下,生產(chǎn)較高產(chǎn)量的谷氨酰胺。vgb是編碼細(xì)菌中血紅素蛋白(VHb)的基因,VHb是以氧合態(tài)參與和氧有關(guān)的代謝,通過(guò)將氧傳遞給呼吸鏈,而調(diào)節(jié)末端氧化酶的活性,改變氧化磷酸化的效率,進(jìn)而改變低氧條件下的代謝途徑,從分子水平上提高重組菌對(duì)氧氣的利用能力,為解決谷氨酰胺大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中要求高溶氧的問(wèn)題提供了一個(gè)想法。谷氨酰胺合成酶突變基因谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶(GS/GOGAT)體系是由銨離子濃度調(diào)節(jié)的,在較低銨離子濃度下發(fā)揮作用,在高銨離子濃度條件下受抑制。谷氨酰胺合成酶的調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)是在其肽鏈405位置的酪氨酸被定點(diǎn)突變?yōu)楸奖彼?,從而失去了這種調(diào)節(jié)機(jī)制,使得谷氨酰胺合成酶可以在高銨離子條件下發(fā)揮催化功能,將谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺。中村純等人通過(guò)敲除細(xì)菌染色體上的谷氨酸合酶基因的方法降低細(xì)胞內(nèi)谷氨酸合酶活性,來(lái)減少谷氨酰胺的分解;通過(guò)增加編碼谷氨酰胺合成酶基因的拷貝數(shù)和修飾編碼谷氨酰胺合成酶基因的翻譯控制區(qū),來(lái)增強(qiáng)谷氨酰胺合成酶基因的表達(dá),促使菌體內(nèi)積累更多的谷氨酰胺。鄭強(qiáng)等進(jìn)行g(shù)lnA基因的克隆與過(guò)量表達(dá),利用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的谷氨酸為底物,在glnA基因表達(dá)的GS酶的催化下,誘導(dǎo)后的重組茵發(fā)酵液中的L-谷氨酰胺產(chǎn)量提高了1.8倍,培養(yǎng)基質(zhì)中的銨鹽反應(yīng)生成L-谷氨酰胺,理論上可以節(jié)
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