蛋白質(zhì)與酶工程

第七章酶(蛋白質(zhì))的基因水平分子改造（蛋白質(zhì)工程）基因水平的蛋白質(zhì)分子改造是采用定點(diǎn)突變對蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行改造，改變蛋白質(zhì)的氨基酸獲得具有預(yù)期性狀的蛋白質(zhì)。突變酶新酶克隆酶分子設(shè)計(jì)第一節(jié)概述一、基因水平分子改造的基本程序第一，分離純化需改造的目標(biāo)蛋白；第二，目標(biāo)蛋白的序列分析、結(jié)構(gòu)分析和功能分析；第三，分子設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)預(yù)測（計(jì)算機(jī)模擬）；第四，分離克隆目標(biāo)蛋白的編碼基因；第五，基因定點(diǎn)突變；第六，突變基因的表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)第七，突變蛋白的分離純化與功能檢測二、基因水平分子改造的基本內(nèi)容①改變酶促反應(yīng)的Km與Vmax，可改變反應(yīng)的催化效率；②改變蛋白的pH值或溫度穩(wěn)定范圍，可改變蛋白的作用條件；③改變蛋白在非水溶劑中的反應(yīng)性，可使蛋白在非生理?xiàng)l件下作用；④改變某種酶，使其不再需要加入輔助因子，簡化持續(xù)生產(chǎn)過程；⑤提高酶對底物的親和力，以增強(qiáng)酶的專一性，減少不必要的副反應(yīng)；⑥增強(qiáng)蛋白對胞內(nèi)蛋白酶的抗性，可簡化純化過程，提高產(chǎn)率；⑦改變酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)部位，減少反饋抑制，使產(chǎn)物的產(chǎn)率提高；⑧提高蛋白的抗氧化能力；⑨根據(jù)需要改變酶的底物專一性；⑩改變蛋白發(fā)生作用的種屬特異性。第二節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（ProteinDataBank，PDB）已收集了數(shù)萬個(gè)蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)。

對于PDB中沒有收錄或未見文獻(xiàn)報(bào)道的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)分析可通過以下方法獲得：

晶體學(xué)技術(shù)：ｘ射線晶體技術(shù)、中子衍射技術(shù)、電子晶體技術(shù)——蛋白質(zhì)晶體構(gòu)象

波譜學(xué)技術(shù)：多維核磁共振（NMR）、電子自旋共振——蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測：根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列構(gòu)建出蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)模型。二、蛋白質(zhì)功能分析生理功能的測定活性位點(diǎn)的測定作用條件的測定根據(jù)已知結(jié)構(gòu)信息化學(xué)修飾和突變方法根據(jù)蛋白質(zhì)同源性第三節(jié)酶（蛋白質(zhì)）的分子設(shè)計(jì)酶（蛋白質(zhì)）分子設(shè)計(jì)就是以酶（蛋白質(zhì)）結(jié)構(gòu)預(yù)測為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)一個(gè)針對性地改造酶（蛋白質(zhì)）分子的方案。一、分子設(shè)計(jì)的類型基于天然蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)小改設(shè)計(jì)（1或幾個(gè)aa替換、刪除、插入）中改設(shè)計(jì)（一個(gè)肽段或一個(gè)結(jié)構(gòu)域）大改設(shè)計(jì)（從頭設(shè)計(jì)）二、分子設(shè)計(jì)的原理

1、內(nèi)核假設(shè)內(nèi)核是指蛋白質(zhì)在進(jìn)化中保守的內(nèi)部區(qū)域。內(nèi)核由氫鍵連接的二級結(jié)構(gòu)單元（α螺旋或β折疊）組成，氫鍵都是最大化的。內(nèi)核都是致密堆積的疏水區(qū)(很少有空穴大到可以結(jié)合一個(gè)水分子或惰性氣體)，并且沒有重疊。

2、疏水或親水氨基酸需要合理地分布疏水性氨基酸通常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的活性中心區(qū)域；環(huán)區(qū)、轉(zhuǎn)角區(qū)和帶電荷區(qū)通常位于蛋白質(zhì)的表面，或在底物結(jié)合區(qū)和配基結(jié)合區(qū)。

3、注意保留脯氨酸、半胱氨酸殘基

脯氨酸是終止α螺旋區(qū)，兩半胱氨酸常形成起穩(wěn)定作用的二硫鍵。

4、注意保留活性中心區(qū)的保守氨基酸殘基

5、注意保留潛在的N糖基化位點(diǎn)（Asn-X-Ser／Thr-X-Pro）中的Asn、Ser或Thr。

6、在金屬蛋白中，配位殘基的替換要滿足金屬配位的幾何要求（鍵長、鍵角）三、分子設(shè)計(jì)的程序

1、以蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)確定突變位點(diǎn)及替換的氨基酸；

2、利用能量優(yōu)化及蛋白質(zhì)動力學(xué)方法預(yù)測改造后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；

3、預(yù)測的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能或功能-穩(wěn)定性相關(guān)知識及理論計(jì)算，預(yù)測新蛋白質(zhì)可能的性質(zhì)和功能。第四節(jié)基因定點(diǎn)突變寡核苷酸介導(dǎo)法

PCR突變法盒式突變法

DNAshuffling（結(jié)構(gòu)域互換、片段重組）一、寡核苷酸介導(dǎo)法

寡核苷酸介導(dǎo)法是指通過突變寡核苷酸引物在DNA合成中引起目的基因特定位點(diǎn)發(fā)生核苷酸插入、缺失或取代等突變。1、原理與程序測序驗(yàn)證及突變基因片段回收表達(dá)載體構(gòu)建突變蛋白的表達(dá)分離純化及功能分析

2、突變寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)原則

①必須與模板鏈上的目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)；

②必須足夠長以便特異地與目標(biāo)DNA序列退火；單個(gè)核苷酸改變：17nt~19nt

兩個(gè)以上毗鄰核苷酸改變：＞25nt③突變核苷酸應(yīng)位于引物中央；

④應(yīng)避免可形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)；

⑤不能同模板的非突變區(qū)段形成穩(wěn)定的雜交體。

3、具體操作方法

①單引物法

突變引物②雙引物法突變引物、通用的測序引物以上兩種方法的突變率只有1%~5%

③Kunkel突變法雙引物、dU-模板，突變率達(dá)80%以上UUUUUUUUUUUUUUUUUU3’5’Pung-：尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷

dut-：dUTP酶缺陷轉(zhuǎn)染野生型株系模板鏈降解Kunkel方法宿主：E.coli

CJ236品系（dut-ung-）關(guān)鍵技術(shù)：制備高質(zhì)量的含U的單鏈DNA模板二、PCR突變法

利用PCR技術(shù)在體外進(jìn)行定點(diǎn)突變，可使突變體大量擴(kuò)增，提高突變效率。

1、產(chǎn)生取代突變的PCR突變法

2、產(chǎn)生插入突變的PCR突變法

3、產(chǎn)生缺失突變的PCR突變法三、盒式突變法（片段取代法）

利用DNA體外重組技術(shù)將一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片斷取代目標(biāo)基因中的相應(yīng)序列。四、DNAshuffling優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)盒式突變法簡單，突變效率高靶DNA區(qū)段兩側(cè)需存在1對限制酶單一切點(diǎn)寡核苷酸介導(dǎo)法較簡單重組子篩選難PCR突變法突變效率100％擴(kuò)增產(chǎn)物需連接到載體上；TaqDNA聚合酶拷貝的保真性第五節(jié)提高酶（蛋白質(zhì)）的應(yīng)用性①提高酶的活性

②提高酶的穩(wěn)定性（耐熱、抗氧化）

③改變酶的底物專一性

④改變酶的最適pH

⑤改變酶對輔酶、輔基的要求

⑥改變酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)功能

⑦提高藥用蛋白的保存期⑧提高藥用蛋白的藥效一、提高T4溶菌酶的熱穩(wěn)定性（引入二硫鍵）具有二硫鍵的蛋白一般不易去折疊，熱穩(wěn)定性較高，且這種蛋白往往在有機(jī)溶劑或非正常生理?xiàng)l件（如極端pH值條件）下也不易變性。酶半胱氨酸的位置和數(shù)目二硫鍵數(shù)目相對活性%Tm/℃野生型酶Cys54、Cys97無10041.9突變酶ACys3、Cys9719646.7突變酶BCys9、Cys164110648.3突變酶CCys21、Cys1421052.9突變酶DCys3、Cys9、Cys97、Cys16429557.6突變酶ECys9、Cys21、Cys142、Cys1642058.9突變酶FCys3、Cys9、Cys21、Cys97、Cys142、Cys1643065.5二、提高酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性

在高溫條件下，Asn與Gln容易脫氨而變成Asp與Glu，這種改變有可能導(dǎo)致肽鏈的局部構(gòu)象發(fā)生改變，從而使蛋白失活。

酶氨基酸及其位置半壽期min野生型酶Asn14、Asn7813突變酶AAsn14、Thr7817突變酶BAsn14、Ile7816突變酶CThr14、Ile7825突變酶DAsp14、Asn7811三、提高重組β干擾素的專一活性和貯存穩(wěn)定性

重組β干擾素的抗病毒活性只有天然的10%，其原因是一些重組β干擾素形成了無活性的二聚體或寡聚體。

β干擾素有3個(gè)Cys，Cys31和Cys141形成分子內(nèi)二硫鍵，帶有游離巰基的Cys17形成分子間二硫鍵。

Cys17→Ser17，突變重組β干擾素的抗病毒活性提高到了100倍，與天然β干擾素相比其貯存穩(wěn)定性大大增強(qiáng)。四、提高α1抗胰蛋白酶的抗氧化性

α1抗胰蛋白酶對嗜中性白細(xì)胞彈性硬蛋白酶的抑制機(jī)理：α1抗胰蛋白酶與嗜中性白細(xì)胞彈性硬蛋白酶迅速結(jié)合，并切斷α1抗胰蛋白酶Met358和Ser359之間的肽鍵，形成更加穩(wěn)定復(fù)合體。氧化作用可使α1抗胰蛋白酶的Met358轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼醽嗧?，不被嗜中性白?xì)胞彈性硬蛋白酶切割，其抑制作用極差。

Met358→Val358，α1抗胰蛋白酶的抗氧化能力增強(qiáng)。五、改變枯草桿菌蛋白酶的動力學(xué)活性酶第222位氨基酸KcatKm野生型蛋白酶Met501.4×10-4工程蛋白酶ACys844.8×10-4工程蛋白酶BSer276.3×10-4工程蛋白酶CAla407.3×10-4工程蛋白酶DLeu52.6×10-4

在lmol／L雙氧水環(huán)境中那些突變成不能氧化的氨基酸（如Ser、Ala或Leu）的酶仍保持活性，而野生型酶和替換成Cys的突變酶則很快就失活了。

六、改變枯草桿菌蛋白酶的最適pH

將枯草桿菌蛋白酶活性中心附近的一個(gè)Asp突變成Ser后，枯草桿菌蛋白酶的最適pH值下降了0.3個(gè)單位。七、提高水蛭素的凝血酶抑制活性

把47位的Asn變成Lys或是Arg時(shí)，它在試管中的抗凝血效率提高了4倍，是一種效果更強(qiáng)的抗凝血劑。在動物上檢驗(yàn)其抗血栓形成的效果，發(fā)現(xiàn)其效率提高了20倍，甚至比肝素都高5倍。八、提高酪氨酰-tRNA合成酶的活性突變氨基酸KcatKmKcat/KmThr51

（野生）4.72.51.860Ala514.01.2