第9章 生物芯片

第九章生物芯片biochip2/1/2023海南大學農學院wss12/1/202322/1/202332/1/202342/1/20235何為生物芯片？生物芯片是通過平面微細加工技術在固體芯片表面構建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白、核酸以及其他生物組分的準確、快捷、大信息量的檢測。生物芯片包括2/1/20236生物芯片的分類

2/1/20237根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。2/1/20238生物芯片分析過程試樣處理點陣固定反應或雜交芯片制作標記洗滌檢測掃描光刻合成微量點樣噴墨純化、標記光化學檢測電化學檢測計算處理2/1/20239內容提要第一節(jié) 基因芯片第二節(jié) 蛋白質芯片第三節(jié) 芯片實驗室2/1/202310基因芯片技術的概念基因芯片(Genechip)技術是指通過微陣列(Microarray)技術將高密度DNA片段陣列通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術?；蛐酒址QDNA芯片。第一節(jié)基因芯片2/1/202311基因研究的前沿技術-----基因芯片技術測序類基因芯片類PCR類2/1/202312基因芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray2/1/202313DNA芯片的主要類型按制備方式分：原位合成芯片：采用顯微光蝕刻等技術在特定部位原位合成寡核苷酸(ONA)而制備的芯片。合成的序列較短cDNA微集陣列：將通過mRNA制備的（cDNA)片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片(CDA)。固定基因的來源較靈活2/1/202314按探針分類：DNA芯片寡核苷酸陣列（芯片）基因組芯片cDNA芯片2/1/202315一、基本原理基因芯片的工作原理與經典的核酸分子雜交方法（southern

、northern）相似。核酸印跡：將待測樣品DNA（靶基因）固定于支持物上，用已知序列DNA片段制作探針，二者按堿基互補配對原理雜交，檢測出欲鑒定的基因。基因芯片：將大量已知基因片段（與核酸印跡相反）以微陣列方式固定在支持物上，待測樣品用熒光染料標記制成探針，當探針與芯片上的靶基因雜交后，通過隨后的信號檢測進行定性與定量分析?；蛐酒谝晃⑿〉幕砻婕闪舜罅康腄NA分子，能夠在同一時間內平行分析大量的基因，進行大信息量的篩選與檢測分析。2/1/202316二、基因芯片的制作DNA芯片技術流程圖芯片制作樣品的制備顯微光蝕刻壓電打印分子打印原位合成芯片固定基因設計與制備支持物預處理打印固化DNA微集陣列樣品核酸的提取與純化擴增與標記標記樣品的純化雜交及雜交后清洗掃描與分析2/1/202317基因芯片技術流程

1.芯片制備-目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA按順序排列在載體上。芯片的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機器人技術。以便能快速、準確地將探針放置到芯片上的指定位置。

2.樣品制備-生物樣品往往是復雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應，有時樣品的量很小。所以，必須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的蛋白質或DNA、RNA，然后用熒光標記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。2/1/202318

3.雜交反應-雜交反應是熒光標記的樣品與芯片上的DNA片段進行的反應,產生一系列信息的過程。選擇合適的反應條件能使生物分子間反應處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配率。

4.信號檢測和結果分析-雜交反應后的芯片上各個反應點的熒光位置、熒光強弱經過芯片掃描儀和相關軟件可以分析圖像，將熒光轉換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關生物信息。2/1/202319基因芯片的基本要素固相介質有硅片、二氧化硅、玻璃、尼龍膜、塑料等。靶片段

DNA、寡核苷酸、RNA等。探針

mRNA，或是以mRNA為模板合成的cDNA。標記物常采用熒光劑，如Cy3、Cy5，

同位素、地高辛等。2/1/202320

1.支持物的預處理（略）

2.制作DNA芯片(1)原位合成芯片的制備

A.光引導原位聚合技術：支持物表面活性基團連接有光敏保護基團（X）受到保護。

優(yōu)點：合成效率高，點陣密度高；

缺點：設備昂貴，技術復雜，反應產率低。(一)芯片的制備2/1/202321原位合成(InSituSynthesis)2/1/202322B.壓電打印法：壓電毛細管噴射器

優(yōu)點：設備廉價，技術相對簡單，反應產率高。

缺點：點陣密度低，易產生交叉污染。2/1/202323(2)DNA微集陣列的制備方式：預先合成寡聚核苷酸、cDNA或DNA基因組通過高速點樣打印到芯片上。A.DNA片段的制備已克隆的基因片段PCR，RT-PCR擴增的基因片段人工合成的DNA片段單鏈、雙鏈、DNA或RNA均可2/1/202324B.打印噴墨打?。ǚ墙佑|式點樣）優(yōu)點、缺點針式打?。ń佑|式點樣）優(yōu)點、缺點2/1/202325點陣芯片的制作技術2/1/202326DNA點陣芯片2/1/202327C.固化打印DNA片段后，需要將其固定在支持物表面，同時也要封閉支持物上未打印區(qū)域以防止核酸樣品的非特異性固定。2/1/202328(二)測定樣品的準備1.樣品的分離純化DNA,mRNA2.擴增PCR,RT—PCR，固相PCR3.標記等過程熒光標記（常用Cy3、Cy5），生物素,放射性標記4.標記后樣品的純化2/1/20232916economicalandsensitiviefluorescentdyealternativesscannedwithScanArray5000.多種熒光染料2/1/202330(三)分子雜交樣品與DNA芯片上的陣列進行雜交。與經典分子雜交的區(qū)別：雜交時間短，30分鐘內完成；可同時平行檢測許多基因序列。影響雜交反應的因素：鹽濃度、溫度、反應時間、DNA二級結構2/1/202331芯

片

合

成

程

序2/1/202332(四)檢測分析激光激發(fā)使含熒光標記的DNA片段發(fā)射熒光激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點的信號軟件進行進行圖象分析和數(shù)據(jù)處理2/1/202333芯片信息采集：熒光標記雙波長掃描激光激發(fā)光源共聚焦掃描計算機處理2/1/202334ScanArray

Lite

2/1/202335三、DNA芯片技術的應用2/1/2023海南大學農學院wss36（一）應用之一：基因表達譜（geneexpressionpattern)BiologicalSampleFunctionalInformation紅色上調黃色不變綠色下調2/1/202337基因表達譜芯片應用最為廣泛，技術上也最成熟。這種芯片可以檢測整個基因組范圍的眾多基因在mRNA表達水平的變化。它能對來源于不同個體、不同組織、不同細胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同生理病理、不同刺激條件下的組織細胞內基因表達情況進行對比分析。從而對基因群在個體特異性、組織特異性、發(fā)育特異性、分化特異性、疾病特異性、刺激特異性的變化特征和規(guī)律進行描述。2/1/202338進一步闡明基因的相互協(xié)同、抑制、互為因果等關系。有助于理解基因及其編碼的蛋白質的生物學功能，并從已知生物學功能的基因推論未報道基因的生物學意義。同時，還可在基因水平上解釋疾病的發(fā)病機理，為疾病診斷、藥效跟蹤、用藥選擇等提供有效手段。急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表達譜芯片的研究。2/1/202339應用舉例：檢測人正常肝細胞與肝癌細胞中差別表達的基因將4096條人cDNA制備成表達芯片。（1500條為已知基因，2548未知，16個陰性對照基因，32個空白點。）提取人正常肝和肝癌組織mRNA，逆轉錄成cDNA。將Cy3和Cy5熒光分別標記到兩種來源的cDNA。與芯片雜交、掃描。計算機數(shù)據(jù)處理，判斷差別表達的基因。標準：1、Cy3與Cy5表達差別>2。

2、Cy3或Cy5信號值>1000。2/1/202340（二）DNA測序：雜交測序（SBH）TCGGATCGCGGATCGAGGATCGACGATCGACTATCGACTTTCGGATCGCGGATCGAGGATCGACGATCGACTATCGACTTTCGGATCGACTTAGCCTAGCTGAA65536個八核苷酸陣列2/1/202341生物芯片能為現(xiàn)代醫(yī)學科學及醫(yī)學診斷學的發(fā)展提供強有力的手段，促進醫(yī)學從“系統(tǒng)、血管、組織和細胞層次”(通常稱之為“第二階段醫(yī)學”)向“DNA、RNA、蛋白質及其相互作用層次”(第三階段醫(yī)學)過渡，使之快速進入實際應用。（三）臨床診斷2/1/202342（四）基因診斷：尋找和檢測與疾病相關的基因及在RNA水平上檢測致病基因的表達（五）藥物研究與開發(fā)：

1.藥物篩選

2.合理用藥

3.中草藥鑒定（六）癌癥研究2/1/202343基因芯片的優(yōu)點：高通量大規(guī)模高度平行性快速高效高靈敏度高度自動化2/1/202344基因芯片的缺點

基因芯片的缺點在于其不能對待檢測基因在多細胞類型組織中的精確定位進行判斷。另外很多蛋白質調節(jié)其功能不主要是依賴其是否表達或表達量高低，而是依賴蛋白質磷酸化-去磷酸化等方式。在這種情況下，用核酸類生物芯片就沒有什么意義了，正在研究開發(fā)中的蛋白類芯片可能會有所作為的。

2/1/202345內容提要第一節(jié) 基因芯片第二節(jié) 蛋白質芯片第三節(jié) 芯片實驗室2/1/202346固定于載體上的蛋白質樣品（靶蛋白）以陣列方式構成，待測樣品用熒光染料或同位素標記制備成探針與芯片雜交，雜交信號用激光掃描儀或放射自顯影檢測及計算機分析檢測結果。蛋白質芯片適合于蛋白質－蛋白質、蛋白質－核酸（DNA、RNA）、蛋白質－小分子之間的相互作用分析；適合功能基因組、蛋白組研究。第二節(jié)蛋白質芯片2/1/202347一、蛋白質芯片特點蛋白質不能用擴增方法提高拷貝數(shù)來達到要求的靈敏度；蛋白質與蛋白質間的特異作用主要是抗原－抗體或配體－受體的反應；反應的實質是專一性，而非序列的特異性。2/1/202348二、蛋白組研究動態(tài)雙向電泳蛋白質芯片雙鏈DNA芯片與相關蛋白質的作用2/1/202349三、制備蛋白質芯片蛋白質分子以共價結合方式固定于玻片固定封阻醛基化（適合蛋白質分子）共價結合法：BSA-羥基琥珀?；ㄟm合多肽、小分子蛋白）2/1/202350四、制備蛋白質探針待測蛋白質樣品經熒光染料、生物素等標記，制成探針。熒光染料：熒光素、羅丹明、德克薩斯紅等；生物素標記：偶聯(lián)法標記抗體、標記蛋白質；金標記：以金粒的電子密度大的特點，與抗體偶聯(lián)，經特異性的反應，通過電子顯微鏡觀察膠體金顆粒，顯示細胞、組織反應的實質即部位。2/1/202351五、蛋白質芯片應用1.蛋白質－蛋白質相互作用檢測圖譜；2.酶－底物相互作用，分析酶的化學及酶的反應動力學；3.分析基因表達與篩選抗體；4.建立蛋白質譜，診斷疾病，直接采患者的血清或體液進行快速診斷。2/1/202352雙鏈DNA芯片與相關蛋白質的作用DNA的轉錄的起始或終止都與