生物科學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課

課程：細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)授課老師：張金葉,龔慧明授課班級(jí)：11/12級(jí)生物科學(xué)授課時(shí)間：2013-2014年度上半學(xué)期學(xué)時(shí)：18學(xué)時(shí)考核：60%考試+40%實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程要求實(shí)驗(yàn)室規(guī)則（服裝整潔、秩序井然、前后清點(diǎn)、節(jié)約與賠償、清潔衛(wèi)生）實(shí)驗(yàn)報(bào)告（實(shí)驗(yàn)報(bào)告及時(shí)完成，有所思考）繪圖要求（鉛筆、清晰、突出典型特征、不抄繪、引線、注字及放大倍數(shù)）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)一普通顯微鏡及特殊顯微鏡的使用實(shí)驗(yàn)二

細(xì)胞膜的通透性觀察實(shí)驗(yàn)三死活細(xì)胞的鑒別實(shí)驗(yàn)四人微量外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)五

人染色體標(biāo)本的制備實(shí)驗(yàn)六人染色體分帶技術(shù)——G帶實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理試劑與器材實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)作業(yè)與思考實(shí)驗(yàn)一普通顯微鏡及特殊顯微鏡的使用一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馍镲@微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和倒置顯微鏡的構(gòu)造原理，并掌握其使用方法。熟悉光鏡下細(xì)胞的基本形態(tài)與結(jié)構(gòu)。掌握顯微鏡暗視野的簡(jiǎn)易制作。二.實(shí)驗(yàn)原理顯微鏡的工作原理成像原理照明原理主要性能參數(shù)顯微鏡成像原理顯微鏡的工作原理暗視野顯微鏡以丁達(dá)爾現(xiàn)象為原理。

特點(diǎn)：利用拋物型聚光器進(jìn)行斜射照明顯微鏡的工作原理顯微鏡照明原理顯微鏡的工作原理臨界照明科勒照明正置顯微鏡倒置顯微鏡倒置熒光顯微鏡三目暗視野顯微鏡倒置激光共聚焦顯微鏡顯微鏡主要性能參數(shù)分辨率（分辨力）指在25cm的明視距離處能區(qū)分開(kāi)被檢物體上兩個(gè)相近質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。放大率與有效放大倍數(shù)放大率/放大倍數(shù)(M)=目鏡放大倍數(shù)(Mob)×物鏡放大倍數(shù)(Moc)有效放大倍數(shù)：物鏡數(shù)值孔徑的500-1000倍。清晰度

指顯微鏡形成輪廓明顯的物象的能力。焦點(diǎn)深度

當(dāng)顯微鏡對(duì)標(biāo)本的某一點(diǎn)或平面聚焦時(shí)，焦點(diǎn)平面上下物象清晰的距離或深度。三.試劑與器材

材料：柿胞間連絲裝片、動(dòng)物細(xì)胞分裂裝片和浮游生物等。試劑：香柏油、二甲苯等器材：生物顯微鏡、暗視野顯微鏡、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、載玻片、蓋玻片等。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容普通生物顯微鏡的構(gòu)造及使用方法。觀察標(biāo)本，熟悉細(xì)胞的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)。暗視野顯微鏡的簡(jiǎn)易制作及浮游生物的觀察。三.實(shí)驗(yàn)步驟顯微鏡的構(gòu)造及使用暗視野顯微鏡的制作及使用亮度調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)鏡筒目鏡目鏡鏡臂物鏡載物臺(tái)物鏡轉(zhuǎn)換器聚光鏡底座調(diào)焦器聚光鏡升降輪顯微鏡的構(gòu)造頭部固定螺釘顯微鏡的使用柿細(xì)胞胞間連絲動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂過(guò)程注意事項(xiàng)任何旋鈕轉(zhuǎn)動(dòng)有困難時(shí)，絕不能用力過(guò)大，而應(yīng)查明原因，排除障礙。如果自己不能解決時(shí)，要向老師說(shuō)明，幫助解決。保持顯微鏡的清潔，盡量避免灰塵落到鏡頭上；盡量避免試劑或溶液沾污或滴到顯微鏡上。顯微鏡用過(guò)后，應(yīng)用清潔棉布輕輕擦拭；鏡頭有灰塵，必須用擦鏡紙擦。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束，把顯微鏡以拿出時(shí)的樣子放回到鏡盒里（即轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡頭，使之“八”字形向外；降低鏡筒至底部）。制作暗視野紙片空隙大小適中才能取得較好的觀察效果。注意根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂特征來(lái)辨別細(xì)胞分裂的各個(gè)時(shí)相。作業(yè)思考繪出你所觀察到的柿胞間連絲、動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂及暗視野下浮游生物圖片。為什么在觀察動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本時(shí)，同一標(biāo)本中會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞分裂的不同時(shí)相？在制作暗視野時(shí)，應(yīng)注意哪些關(guān)鍵環(huán)節(jié)？End，ThankS！實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞膜的通透性觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理試劑與儀器實(shí)驗(yàn)內(nèi)容注意事項(xiàng)作業(yè)與思考一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察細(xì)胞膜的通透性。了解溶血現(xiàn)象及其發(fā)生機(jī)制。掌握普通光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞及細(xì)胞碎片的形態(tài)。細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的選擇通透性屏障。溶血現(xiàn)象：將紅細(xì)胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲到細(xì)胞內(nèi)，可使細(xì)胞脹破，血紅蛋白釋放到介質(zhì)中，由不透明的紅細(xì)胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅蛋白溶液的現(xiàn)象。將紅細(xì)胞放在某些等滲鹽溶液中，由于紅細(xì)胞膜對(duì)各種溶質(zhì)的通透性不同，膜兩側(cè)的滲透壓平衡會(huì)發(fā)生改變，也會(huì)發(fā)生溶血現(xiàn)象。因此，發(fā)生溶血現(xiàn)象所需時(shí)間長(zhǎng)短可作為測(cè)量物質(zhì)進(jìn)入紅細(xì)胞速度的一種指標(biāo)。二.實(shí)驗(yàn)原理三.試劑和儀器材料：雞血細(xì)胞器材：普通顯微鏡、試管、試管架、滴管、載玻片、蓋玻片、擦鏡紙、記號(hào)筆等。試劑：0.17mol/LNaCl、0.17mol/LNH4Cl、0.17mol/L醋酸銨、0.17mol/L硝酸銨、0.12mol/L草酸銨、0.12mol/LNaSO4溶液、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、

0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮、蒸餾水。雞紅細(xì)胞懸液的制備。低滲溶血的觀察。顯微鏡檢查細(xì)胞的完整性。四.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容五.注意事項(xiàng)膠頭滴管不可混用，以免造成溶液間的交叉污染。試管中有紅細(xì)胞和測(cè)試溶液時(shí)，不應(yīng)強(qiáng)力搖晃，以免造成人為的紅細(xì)胞破裂。注意組實(shí)驗(yàn)過(guò)程的同步性，尤其滴加血液的操作要迅速。六.作業(yè)與思考記錄各種溶液所發(fā)生的溶血現(xiàn)象及溶血時(shí)間。比較并分析各種溶液發(fā)生溶血現(xiàn)象的原理。為什么同一種溶液，有的同學(xué)會(huì)得出不同的結(jié)論？思考溶血實(shí)驗(yàn)在研究中應(yīng)用的可能性。試管編號(hào)所加試劑是否溶血溶血時(shí)間結(jié)果分析End，ThankS！溶血實(shí)驗(yàn)在研究中的應(yīng)用1.溶血空斑實(shí)驗(yàn)

溶血空斑實(shí)驗(yàn)是體外檢測(cè)單個(gè)抗體形成細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）的一種方法，即將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）免疫過(guò)的家兔淋巴結(jié)或小鼠脾臟制成細(xì)胞懸液，與一定量的SRBC結(jié)合，于37℃作用下，免疫活性淋巴細(xì)胞能釋放出溶血素，在補(bǔ)體的參與下，使抗體形成細(xì)胞周?chē)腟RBC溶解，從而在每一個(gè)抗體形成細(xì)胞周?chē)?，形成肉眼可?jiàn)的溶血空斑。每個(gè)空斑表示一個(gè)抗體形成細(xì)胞，空斑大小表示抗體生成細(xì)胞產(chǎn)生抗體的多少。由于溶血空斑實(shí)驗(yàn)具有特異性高，篩選力強(qiáng)，可直接觀察等優(yōu)點(diǎn)，故可用做判定免疫功能的指標(biāo)，觀察免疫應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)變化，并可進(jìn)行抗體種類(lèi)及亞類(lèi)的研究。

2.有時(shí)在提紅細(xì)胞膜蛋白時(shí)要用到，先用低滲溶液讓紅細(xì)胞脹破，高速離心收集、純化膜蛋白。實(shí)驗(yàn)三死活細(xì)胞的鑒別實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理

材料、試劑與器材

方法與步驟注意事項(xiàng)

作業(yè)與思考一實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握死活細(xì)胞鑒別的原理及方法。二實(shí)驗(yàn)原理死活細(xì)胞的鑒別方法：質(zhì)壁分離法

、染色法和儀器分析法染色法（化學(xué)染色和熒光染色）其原理是：許多酸性染料不容易穿過(guò)活細(xì)胞的質(zhì)膜進(jìn)入胞內(nèi)，卻能滲入死亡的細(xì)胞內(nèi)，使其著色，以此來(lái)鑒別死活細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色法、甲基藍(lán)染色、伊紅Y。微電極技術(shù)（利用死活細(xì)胞膜兩側(cè)電位的差異）、全自動(dòng)分析細(xì)胞記數(shù)儀和流式細(xì)胞儀。儀器分析法中性紅染色、美藍(lán)染色、熒光素雙醋酸酯染色、二丙酸脂熒光素染色、

Hoechst、碘化丙啶（PI）。其原理是：許多堿性染料能夠滲入到活細(xì)胞內(nèi)，由于活細(xì)胞的代謝作用而是其顯色。死細(xì)胞染色活細(xì)胞染色死活細(xì)胞鑒定原理依據(jù)死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異不同。圖1.血球計(jì)數(shù)板示意圖A：血球計(jì)數(shù)板正面；B：血球計(jì)數(shù)板側(cè)面1.血球計(jì)數(shù)板；2.蓋玻片；3.計(jì)數(shù)室圖2.血球計(jì)數(shù)板1mm25個(gè)中格：1mL培養(yǎng)液中細(xì)胞數(shù)=N/5x25x10000x稀釋倍數(shù)16個(gè)中格：1mL培養(yǎng)液中細(xì)胞數(shù)=N/4x16x10000x稀釋倍數(shù)材料：血細(xì)胞試劑：0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液（生理鹽水配制）、PBS。器材：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、滴管等。三材料、試劑與器材四方法與步驟血細(xì)胞懸液的制備取一定量的新鮮血液加入20等份的PBS。染色制片取0.5ml細(xì)胞懸液放入干凈試管中，加入1-2滴臺(tái)盼藍(lán)染液，混合，2min后制成臨時(shí)裝片，鏡檢。3.細(xì)胞存活率的計(jì)算

細(xì)胞存活率=（細(xì)胞總數(shù)-死細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%五注意事項(xiàng)計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)多選擇幾個(gè)視野，以多個(gè)視野內(nèi)的平均值作為細(xì)胞的存活率。以臺(tái)盼藍(lán)排除法在顯微鏡下計(jì)數(shù)死活細(xì)胞數(shù)目需注意染色時(shí)間。六作業(yè)與思考計(jì)數(shù)死活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出細(xì)胞存活率。討論細(xì)胞存活率在研究中的應(yīng)用和意義。①中性紅染色：常用染料之一，是細(xì)胞器的專(zhuān)有染料。利用細(xì)胞膜的通透性差異，用來(lái)染原生動(dòng)物和顯示動(dòng)植物組織中活細(xì)胞的內(nèi)含物等。中性紅無(wú)毒，常做活體染色的染料。②臺(tái)盼藍(lán)染色：當(dāng)細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)的是細(xì)胞膜的完整性，通常認(rèn)為細(xì)胞膜喪失完整性，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡。通過(guò)顯微鏡很容易就能識(shí)別出死亡的被臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞，并可使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。③美藍(lán)染色法：美藍(lán)是一種無(wú)毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的，而還原型是無(wú)色的，用它來(lái)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色，由于細(xì)胞中新陳代謝的作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的還原型，所以活細(xì)胞無(wú)色，而對(duì)于死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們無(wú)此還原能力或還原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。因此，用美藍(lán)水浸片不僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細(xì)胞.④甲基藍(lán)染色法：甲基藍(lán)染色與臺(tái)盼藍(lán)類(lèi)似的染色機(jī)理。每個(gè)血球計(jì)數(shù)板上有兩個(gè)計(jì)數(shù)室（圖1）。血球計(jì)數(shù)板上的符號(hào)和數(shù)字（圖1）的含義是：XB-K-25為計(jì)數(shù)板的型號(hào)和規(guī)格，表示此計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)室分25個(gè)中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的高；1/400mm2表示計(jì)數(shù)室面積是1mm2（計(jì)數(shù)室邊長(zhǎng)1mm），分400個(gè)小格，每小格面積是1/400mm2（圖2），9個(gè)大方格中只有中間的有小方格的中央大方格才是計(jì)數(shù)室。不要認(rèn)為9個(gè)大方格都是計(jì)數(shù)室。

計(jì)數(shù)室通常也有兩種規(guī)格：一種是16x25型，即大方格內(nèi)分為16中格，每一中格又分為25小格（圖2）；另一種是25x16型，即大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即每一大方格都是由16x25=25x16=400個(gè)小方格組成。

計(jì)數(shù)時(shí)，若計(jì)數(shù)室是由16個(gè)中方格組成，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)中方格（即100個(gè)小方格）的菌數(shù)。如果是由25個(gè)中方格組成的計(jì)數(shù)室，除數(shù)上述4個(gè)中方格外，還需數(shù)中央1個(gè)中方格（即80個(gè)小格方）的菌數(shù)（圖3）。計(jì)數(shù)時(shí)對(duì)壓在中格四條線上的細(xì)胞只計(jì)數(shù)相鄰兩邊及其夾角上的細(xì)胞（一般選左邊和上邊的線）。

死活細(xì)胞的鑒定在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)上具有很重要的意義。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中要隨時(shí)記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，需要經(jīng)常測(cè)定細(xì)胞的存活率；在腫瘤細(xì)胞的研究中，為了檢驗(yàn)各種藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，也需要測(cè)定腫瘤細(xì)胞的存活率。在臨床醫(yī)學(xué)中死活細(xì)胞的鑒定也有很大的應(yīng)用，例如為了檢測(cè)某一男子的生育能力，測(cè)定精子細(xì)胞的存活力是比較常用的辦法。實(shí)驗(yàn)四人微量外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理

試劑與器材

操作方法

注意事項(xiàng)

作業(yè)與思考一實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諢o(wú)菌培養(yǎng)技術(shù)。熟悉人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程。并掌握人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)方法。二實(shí)驗(yàn)原理在活體情況下，進(jìn)入外周血的小淋巴細(xì)胞不能進(jìn)行增殖，存活一定時(shí)間即死亡。在人工培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中的PHA有刺激小淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化并進(jìn)行分裂的能力，此時(shí)如加入秋水仙素，可使許多細(xì)胞停滯于分裂中期。采用常規(guī)制片技術(shù)，即可獲得大量含染色體的標(biāo)本。三試劑與器材

材料：人指血。試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、肝素、PHA、

雙抗、PBS，2μg/ml的秋水仙素、酒精等。器材：超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、注射器、燒杯、

量筒、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、酒精燈等。四實(shí)驗(yàn)內(nèi)容采樣接種

在無(wú)菌條件下，用采血針刺破無(wú)名指，采血4~5滴，接種至培養(yǎng)瓶，塞緊瓶塞后輕搖均勻，盡量避免與瓶蓋接觸。采血后，用膠布密封瓶口并作好標(biāo)記。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容培養(yǎng)將標(biāo)記好的培養(yǎng)瓶置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，每隔12小時(shí)左右輕遙1次，以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。四實(shí)驗(yàn)內(nèi)容加秋水仙素終止培養(yǎng)前6小時(shí)以注射器向培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素3-4滴，使其終濃度為0.01-0.02μg/ml，振蕩混勻后于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。五注意事項(xiàng)嚴(yán)格注意采血過(guò)程的無(wú)菌操作。采血時(shí)，采血針不可混用。采血后，各自的培養(yǎng)瓶應(yīng)做好標(biāo)記。六作業(yè)與思考簡(jiǎn)述人外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程。肝素和PHA在人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中的作用是什么？影響人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的主要因素有哪些？如何控制？End，ThankS！RPMI1640

培養(yǎng)基中由多種氨基酸、維生素、生物素、無(wú)機(jī)鹽等按不同比例配置而成，再加入酚紅作指示劑是細(xì)胞體外培養(yǎng)的必要營(yíng)養(yǎng)素。10.4gRPMI1640干粉溶于900ml三蒸水中，磁力攪拌2h，充分溶解，用NaHCO3調(diào)pH=7.2，然后定容至1000ml，無(wú)菌室內(nèi)抽濾滅菌、分裝，4℃保存，長(zhǎng)時(shí)間存放英防御-20℃.抗凝劑抗凝劑常采用肝素，肝素鈉。肝素：一種多糖，能阻止白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞集結(jié)在一起而影響培養(yǎng)的質(zhì)量，但肝素濃度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致溶血。一般劑量是100單位肝素液可抗凝5ml外周血液。肝素鈉為粉劑，每毫克130單位。植物凝集素：PHA

從豆子中提取出來(lái)的，其化學(xué)成分為糖蛋白，具有刺激淋巴細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的作用。用量不足影響分裂細(xì)胞的數(shù)量；用量過(guò)高則使培養(yǎng)的外周血凝集而影響淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)。秋水仙素

是從地中海的一種名叫秋水仙的鱗莖中提取的一種植物堿，他的作用是：

（1）抑制細(xì)胞紡錘死的形成，使細(xì)胞分裂停止在中期，從而起到積累大量中期細(xì)胞的作用。

（2）是染色體單體縮短分開(kāi)，呈現(xiàn)明顯的外形。秋水仙素的使用濃度范圍比較寬，可差幾十倍之多，一般終濃度為1.2-1.5微克/毫升。處理4-6小時(shí)。秋水仙素作用時(shí)間越長(zhǎng)，被阻止的中期細(xì)胞越多，但染色體也會(huì)收縮，收縮過(guò)度會(huì)影響形態(tài)。

實(shí)驗(yàn)五人染色體標(biāo)本的制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理

試劑與器材

操作方法

注意事項(xiàng)

作業(yè)與思考一實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馊旧w制備原理。掌握染色體制備方法。二實(shí)驗(yàn)原理被秋水仙素處理后停滯于中期的大量分裂細(xì)胞，用低滲液處理使樣品中的紅細(xì)胞膜破裂，并使分裂細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞膨脹，結(jié)合離心技術(shù)，即可去掉紅細(xì)胞碎片。再用固定液使已膨脹的分裂細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞膜破裂，隨著分裂細(xì)胞膜破裂，染色體被釋放出來(lái)，并且將其形態(tài)固定下來(lái)，然后制片即可得到滿意的染色體標(biāo)本。三試劑與器材材料

終止培養(yǎng)前6小時(shí)加入秋水仙素的人外周血淋巴細(xì)胞。試劑

低滲液（0.075%KCl溶液）、

固定液（甲醇：冰醋酸=3：1，現(xiàn)用現(xiàn)配）等。器材

離心機(jī)、離心管、倒置顯微鏡、水浴鍋、天平、酒精燈、載玻片和蓋玻片等。四操作方法收集細(xì)胞取出培養(yǎng)瓶，上下顛倒均勻，將細(xì)胞移至離心管內(nèi)，1000r/min離心8min收集細(xì)胞，棄上清。低滲處理

加入已經(jīng)預(yù)熱的低滲液6-8ml，吹打成細(xì)胞懸液，37℃水浴中低滲20min。固定

①預(yù)固定；②固定；③再固定。制片

預(yù)冷的玻片，立即吹干。染色1:10Giemsa染液染色10min，流水沖洗，晾干。鏡檢，拍照。五注意事項(xiàng)從培養(yǎng)箱中取培養(yǎng)瓶時(shí)，注意觀察培養(yǎng)液顏色，根據(jù)顏色變化判斷細(xì)胞有無(wú)污染。用吸管吸棄上清液時(shí)，勿用力過(guò)猛導(dǎo)致部分細(xì)胞丟失。固定液需現(xiàn)用現(xiàn)配。載玻片需干凈且保持濕冷狀態(tài)。六作業(yè)與思考簡(jiǎn)述人外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本制備的過(guò)程。秋水仙素處理、低滲和固定處理在染色體標(biāo)本制備過(guò)程中的作用是什么？固定液為什么要現(xiàn)用現(xiàn)配？End，ThankS！低滲溶液：0.075MKCl低滲溶液使細(xì)胞膨脹，便于染色體分散而易于觀察和計(jì)數(shù)。（1）染色體輪廓較清楚。（2）染色性增強(qiáng)，可縮短染色時(shí)間。（3）用于G帶技術(shù)更能顯示其優(yōu)越性。固定液

穩(wěn)定染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，清除染色體外層物質(zhì)對(duì)染色體在玻片上展開(kāi)的影響，通過(guò)更換固定液2-3次，清除紅細(xì)胞的碎片，使標(biāo)本片的背景更為清晰，廣泛使用的固定液為Carnoy固定液，即甲醇與冰醋酸3:1混合液。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明培養(yǎng)物生長(zhǎng)發(fā)育良好，但制成的標(biāo)本質(zhì)量不佳時(shí)，其原因?yàn)椋呵锼伤靥幚聿划?dāng)：一般秋水仙素溶液的濃度與處理時(shí)間有一定關(guān)系，若處理時(shí)間太短，則標(biāo)本中分裂細(xì)胞就少，相反，雖然標(biāo)本中的分裂細(xì)胞雖多，若處理時(shí)間太長(zhǎng)，染色體縮得太短，以致形態(tài)特征模糊，不容易觀察。低滲處理不當(dāng)：低滲處理細(xì)胞時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜旺旺過(guò)早破裂，以致分裂細(xì)胞或染色體丟失；若處理時(shí)間不足，細(xì)胞膨脹不夠，則染色體分散不佳，難以進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)分析。離心速度不合適：若從培養(yǎng)瓶收集細(xì)胞后進(jìn)行離心時(shí)的速度太低，細(xì)胞可能被丟失；如果細(xì)胞被低滲后離心速度過(guò)高，旺旺使分裂細(xì)胞過(guò)早破裂，分散良好的分裂相丟失，以致制出的標(biāo)本分裂相較少或大部分為剩余的分散不好的分裂相。標(biāo)本固定不充分：若固定液不新鮮，甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，此時(shí)染色體形態(tài)模糊、不分散，其周?chē)屑?xì)胞漿的藍(lán)色背景。載玻片清洗不徹底：玻片有油跡，致使滴在在玻片上的細(xì)胞懸液不能均勻分散，且細(xì)胞隨液體流動(dòng)而丟失。載玻片冷凍不夠：合適的冰濕玻片，從低溫中拿出時(shí)，其表面有一層霜雪。如冷凍不夠則無(wú)此現(xiàn)象，此時(shí)細(xì)胞難以貼附在在玻片上。實(shí)驗(yàn)六人染色體分帶技術(shù)—G帶實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理試劑與器材操作方法注意事項(xiàng)作業(yè)與思考一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握制備G帶染色體方法。了解G帶染色體在細(xì)胞遺傳學(xué)分析中的重要意義。二實(shí)驗(yàn)原理染色體顯帶技術(shù)

將染色體標(biāo)本經(jīng)過(guò)一定程序處理，并用特定染料染色，使染色體沿其長(zhǎng)軸顯現(xiàn)明暗或深淺相間的橫行帶文，這些橫行帶紋為染色體帶。如果染色體上某一區(qū)域的DNA為重復(fù)序列，轉(zhuǎn)錄活性低，相應(yīng)地包裝它們的蛋白質(zhì)也較穩(wěn)定，可能通過(guò)較強(qiáng)的二硫鍵形成很穩(wěn)定的疏水的a-螺旋結(jié)構(gòu)，成為染料沉淀物積累的環(huán)境，從而顯示出陽(yáng)帶(暗帶)。反之，如果染色體上某一區(qū)域的DNA富含具轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)構(gòu)基因，則功能上相對(duì)活躍，包裝它們的蛋白質(zhì)也較疏松，構(gòu)象上類(lèi)似b-折疊結(jié)構(gòu)，經(jīng)處理后二硫鍵斷裂，還原為巰基，成為親水性蛋白，不利于染料沉淀物的積累，所以著色淺，顯示陰帶(明帶)。Giemsa染料是噻嗪-曙紅燃料，著色之一取決于染色體原位形成噻嗪-曙紅沉積物，兩個(gè)噻嗪分子和DNA結(jié)合，在此基礎(chǔ)之上再結(jié)合1個(gè)曙紅分子；其次取決于一個(gè)疏水環(huán)境，以利于燃料沉淀而著色。G帶顯帶在用Gimsa染色以前，要用胰蛋白酶進(jìn)行預(yù)處理，將染色體陰性G帶區(qū)的疏水蛋白除去或使它們的構(gòu)型變?yōu)楦鼮橛H水狀態(tài)，以利于著色。G帶區(qū)含有較豐富的A-T對(duì)，在間期核呈固縮狀態(tài)，是DNA晚復(fù)制區(qū)之一。Giemsa燃料在G帶區(qū)與DNA結(jié)合，而且與結(jié)合DNA的染色質(zhì)非組蛋白有關(guān)。其特性是顯帶方法簡(jiǎn)單恒定，帶型穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)。二實(shí)驗(yàn)原理三試劑與器材材料

人染色體標(biāo)本。試劑GKN液、胰蛋白酶液、Gimsa染液、香柏油等。器材

恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、顯微鏡、染色缸、量筒、燒杯等。四實(shí)驗(yàn)內(nèi)容置70℃烤箱中處理2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入37℃培養(yǎng)箱中備用，一般在第3-7天進(jìn)行顯帶。將染色體標(biāo)本投入胰酶液中，以15s、30s、1min、1.5min、2min不同時(shí)間進(jìn)行預(yù)試片，選擇最佳時(shí)間。（隨著片齡的增長(zhǎng)、時(shí)間也隨之增長(zhǎng)）。在GKN液內(nèi)漂洗30s。Gimsa染液中染色8-10min，流水沖洗。鏡檢。質(zhì)量較好的染色體標(biāo)本可用二甲苯透明，D.P.X(中性樹(shù)脂)封片。男性G顯帶(10××100×)女性G顯帶(10××100×)人類(lèi)23對(duì)染色體的G顯帶記憶口訣一禿二蛇三蝶飄，四像鞭炮五黑腰；六號(hào)像個(gè)小白臉，七蓋八下九苗條；十號(hào)長(zhǎng)臂近帶好，十一低來(lái)十二高；十三、四、五、四二一；十六長(zhǎng)臂縊痕大；十七長(zhǎng)臂帶腳鐐，十八白頭肚子飽；十九中間一點(diǎn)腰，二十頭重腳飄飄；二十一好像黑葫蘆瓢，二十二頭上一點(diǎn)黑；X染色一擔(dān)挑，Y染色長(zhǎng)臂帶黑腳。五注意事項(xiàng)胰蛋白酶處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。觀察染色體標(biāo)本時(shí)，應(yīng)先用低倍鏡再用高倍鏡、油鏡觀察染色體長(zhǎng)軸上明暗和寬度不同的橫紋即帶。油鏡觀察后應(yīng)立即將鏡頭清理干凈。六作業(yè)與思考正常人染色體核型分析。正常人染色體的數(shù)目及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。染色體核型分析在臨床疾病診斷中的作用。End，ThankS！A組：1-3號(hào)染色體。1號(hào)染色體。短臂：近側(cè)段有2條深帶，第2深帶稍寬，在處理較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段可顯出3～4條淡染的深帶。此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)的第1深帶為lp21；第2深帶為1p31。長(zhǎng)臂：副縊痕緊貼著絲粒，染色濃。其遠(yuǎn)側(cè)為一寬的淺帶，近中段與遠(yuǎn)側(cè)段各有兩條深帶，此中段第2深帶染色較濃，中段兩條深帶稍靠近，此臂分為4個(gè)區(qū)，副縊痕遠(yuǎn)側(cè)的淺帶為lp21號(hào)帶、中段第2深帶為lp31號(hào)帶，遠(yuǎn)側(cè)段第1深帶為lp41號(hào)帶。2號(hào)染色體。短臂：可見(jiàn)4條深帶，中段的2條深帶稍靠近，此臂分為2個(gè)區(qū)，中段兩條深帶之間的淺帶為2p21。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)7條深帶，第3和第4深帶有時(shí)融合。此臂分為3個(gè)區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2p21帶，第4和第5深帶之間的淺帶為2p31號(hào)帶。3號(hào)染色體。在長(zhǎng)臂與短臂的近中段各具有1條明顯的寬的淺帶。短臂：一般在近側(cè)段可見(jiàn)1條較寬的深帶，遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)2條深帶，其中遠(yuǎn)側(cè)1條較窄，且著色淡，這是區(qū)別3號(hào)染色體短臂的顯著特征。在處理較好的標(biāo)本上，近側(cè)段的深帶可分為2條深帶，此臂分2個(gè)區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：一般在近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段各有1條較寬的深帶，在處理好的標(biāo)本上，近側(cè)段的深帶可分為2條深帶，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶可分為3條深帶，此臂分為2個(gè)區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。該染色體的G帶圖有點(diǎn)象蝴蝶結(jié)。B組：4-5號(hào)染色體。4號(hào)染色體短臂：可見(jiàn)2條深帶，近側(cè)深帶染色較淺，短臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)均勻分布的4條深帶，在處理較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的2條深帶可各自分為2條較寬的深帶。此臂分為3區(qū)，近側(cè)段第1和第2深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶，遠(yuǎn)側(cè)段兩條深帶之間的淺帶為3區(qū)1帶。5號(hào)染色體短臂：可見(jiàn)2條深帶，其遠(yuǎn)側(cè)的深帶寬且著色濃，此臂僅1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：近側(cè)段2條深帶，染色較淡，有時(shí)不明顯，中段可見(jiàn)3條深帶，染色較濃，有時(shí)融合成1條寬的深帶，遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)2條深帶，近末端的1條著色較濃，此臂分為3個(gè)區(qū)，中段第2深帶為2區(qū)l帶，中段深帶與遠(yuǎn)側(cè)深帶之間的寬闊的淺帶為3區(qū)1帶。C組：6-12號(hào)和X染色體6號(hào)染色體短臂：中段有1條明顯寬闊的淺帶，形如“小白臉”，是此染色體的特征，近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段各有1條深帶，近側(cè)深帶貼著絲粒。在處理較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶可分為兩條深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段的明顯而寬的淺帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)5條深帶，近側(cè)1條緊貼著絲粒，遠(yuǎn)側(cè)末端的1條深帶著色較淡；此臂分為2個(gè)區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。7號(hào)染色體著絲粒著色濃。短臂：有3條深帶，中段深帶著色較淡，有時(shí)不明顯，遠(yuǎn)測(cè)深帶著色濃，形似“瓶塞”。此臂分為2個(gè)區(qū)，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：有3條明顯深帶，遠(yuǎn)側(cè)近末端的1條著色較淡；第2和第3帶稍接近。此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)第1深帶為2區(qū)1帶、中段的第2深帶為3區(qū)1帶。8號(hào)染色體。短臂：有2條深帶，中段有1條較明顯的淺帶，這是與10號(hào)染色體相鑒別的主要特征。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段的淺帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)3條分界極不明顯的深帶，此臂分2個(gè)區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。9號(hào)染色體著絲粒著色濃。短臂：近側(cè)段和中段各有1條深帶，在處理較好的標(biāo)本上，中段可見(jiàn)2條較窄的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)明顯的2條深帶，次縊痕一般不著色，在有些標(biāo)本上呈現(xiàn)出特有的頸部區(qū)。此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)的1條深帶為2區(qū)1帶，遠(yuǎn)側(cè)的1條深帶為3區(qū)1帶。10號(hào)染色體著絲粒著絲濃。短臂：近側(cè)段和近中段各有1條深帶，在有些標(biāo)本上近中段可見(jiàn)2條深帶，但與8號(hào)染色體短臂比較，其上深帶的分界欠清晰。此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)明顯的3條深帶，遠(yuǎn)側(cè)段的2條深帶稍靠近，這是與8號(hào)染色體相鑒別的一個(gè)主要特征，此臂分為2個(gè)區(qū)，近側(cè)段的1條深帶為2區(qū)1帶。11號(hào)染色體短臂：近中段可見(jiàn)1條深帶，在處理較好的標(biāo)本上，這條深帶可分為3條較窄的深帶。此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：近側(cè)有1條深帶，緊貼著絲粒。遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)1條明顯的較寬的深帶，這條深帶與近側(cè)的深帶之間是1條寬闊的淺帶，這是與12號(hào)染色體相鑒別的一個(gè)明顯的特征，在處理較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的這條較寬的深帶可分為2條較窄的淺帶，兩深帶之間有1條很窄的淺帶，一般極難辨認(rèn)，但它是分區(qū)的一個(gè)界標(biāo)，在有些標(biāo)本上近末端處可見(jiàn)1條窄的淡染的深帶。此臂分2個(gè)區(qū)，上述遠(yuǎn)側(cè)兩條深帶之間的那條很窄的淡帶為2區(qū)1帶。12號(hào)染色體短臂：中段可見(jiàn)1條深帶，此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：近側(cè)有1條深帶，緊貼著絲粒，中段有1條寬的深帶，這條深帶與近側(cè)深帶之間有1條明顯的淺帶，但與11號(hào)染色體比較這條淺帶較窄，這是鑒別11號(hào)與12號(hào)染色體的一個(gè)主要特征。在處理較好的標(biāo)本上，中段這條較寬的深帶可分為3條深帶。其正中一條著色較濃，在有些標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段還可以看到l～2條染色較淡的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段正中的深帶為2區(qū)1帶。X染色體其長(zhǎng)度介于7號(hào)和8號(hào)染色體之間，主要特點(diǎn)是長(zhǎng)臂和短臂中段各有1條深帶，有“一擔(dān)挑”之名。短臂：中段有一明顯的深帶，宛如竹節(jié)狀。在有些標(biāo)本上遠(yuǎn)側(cè)段還可以看見(jiàn)1條窄的著色淡的深帶，此臂分為2個(gè)區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：看見(jiàn)3～4條深帶，近中部1條最明顯，此臂分為2個(gè)區(qū)，近中段的深帶為2區(qū)1帶。D組：13-15號(hào)染色體，具有近端著絲粒和隨體。13號(hào)染色體著絲粒區(qū)深染。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)4條深帶，第1和第4深帶較窄，染色較淡；第2和第3深帶較寬，染色較濃。此臂分為3個(gè)區(qū)，第2深帶為2區(qū)1帶，第3深帶為3區(qū)1帶。14號(hào)染色體著絲粒區(qū)深染。長(zhǎng)臂：近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)各有1條較明顯的深帶。在處理較好的標(biāo)本上，中段尚看見(jiàn)1條著色較淺的深帶。此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)深帶為2區(qū)1帶，遠(yuǎn)側(cè)深帶為3區(qū)1帶。15號(hào)染色體著絲粒區(qū)深染。長(zhǎng)臂：中段有一條明顯深帶；染色較濃，有的標(biāo)本上近側(cè)段可見(jiàn)l～2條淡染的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。E組：16-18號(hào)染色體16號(hào)染色體短臂：中段有1條深帶，在較好的標(biāo)本上看見(jiàn)2條深帶，此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段各有1條深帶。有時(shí)遠(yuǎn)側(cè)段1條不明顯，次縊痕著色濃；此臂分2個(gè)區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。17號(hào)染色體短臂：有1條深帶，緊貼著絲粒，此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：遠(yuǎn)側(cè)段看見(jiàn)1條深帶，這條深帶與著絲粒之間為一明顯而寬的淺帶，此臂分為2個(gè)區(qū)，這條明顯而寬的淺帶為2區(qū)1帶。18號(hào)染色體短臂：一般為淺帶，此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)各有1條明顯的深帶，此臂分為2個(gè)區(qū)，兩深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。19號(hào)染色體著絲粒及其周?chē)鸀樯顜?，其余為淺帶。短臂和長(zhǎng)臂均只有1個(gè)區(qū)。20號(hào)染色體著絲粒區(qū)濃染。短臂有一條明顯的深帶，此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：中段和遠(yuǎn)側(cè)段看見(jiàn)1～2條染色較淡的深帶，有時(shí)全為淺帶。此臂只有1個(gè)區(qū)。此染色體有“頭重腳輕”之名。G組：21-22號(hào)染色體和Y染色體，21、22號(hào)有隨體。21號(hào)染色體著絲粒區(qū)著色淡。其長(zhǎng)度比22號(hào)短，其長(zhǎng)臂上有明