蛋白質(zhì)與酶工程第三章酶的分離純化層析技術(shù)

酶的分離純化

離心技術(shù)

層析技術(shù)第四章層析技術(shù)引言層析法的基本原理層析法的分類(lèi)引言層析法的發(fā)現(xiàn)與進(jìn)化歷史

思想層析法的基本原理根據(jù)引言內(nèi)容,是否可以總結(jié)概括出層析法的基本原理？層析法的分類(lèi)第一節(jié)吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC）引言1850年德國(guó)科學(xué)家朗格首先發(fā)現(xiàn)了色譜分離的現(xiàn)象，當(dāng)他把一種有顏色的物質(zhì)滴到一張濾紙上，觀察到它們擴(kuò)散成一圈圈的圓環(huán)。探索與發(fā)現(xiàn)11906年俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（MichaelTswett）:將碳酸鈣細(xì)粉裝入玻璃瓶，石油醚抽提葉子的色素溶液傾入，接著倒入石油醚洗滌，柱上部出現(xiàn)了綠色的葉綠素，中間是黃色的葉黃素，而在下面則是胡蘿卜素橙黃色色帶叫作“色譜”，方法叫色譜法（Chromatography),層析法。探索與發(fā)現(xiàn)2概念:固定相,流動(dòng)相,色譜柱現(xiàn)代色譜柱圖有誤Whichiswhich?1905-1930.Whocares!Why？1931年德國(guó)庫(kù)恩(Kuhn)重復(fù)了茨維特實(shí)驗(yàn),用氧化鋁和碳酸鈣分離了α-,β-,和γ-胡蘿卜素，此后用這種方法分離了60多種這類(lèi)色素，1938年他從維生素

B

中分離出

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6.1938年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。探索與發(fā)現(xiàn)3WhynotTswett?論文發(fā)表在不知名的期刊上相同時(shí)期發(fā)生在中國(guó)大地的事件1894年：中日甲午戰(zhàn)爭(zhēng),侵占臺(tái)灣。1897年：德國(guó)侵占膠州灣。1900年：八國(guó)聯(lián)軍侵略中國(guó)。1914年：占領(lǐng)青島,奪取膠州灣。1931年：九一八事變,占領(lǐng)東北,建立滿州國(guó)。1937年：盧溝橋事變。1941年生物化學(xué)家Martin（馬丁）和Synge（辛格）把色譜法應(yīng)用于氨基酸的分離。將淀粉作為色柱里的填料:淀粉色譜法濾紙作為載體:紙色譜法覆蓋了吸附劑表面的并與流動(dòng)相不發(fā)生混溶的固定液來(lái)代替以前的固體吸附劑:Liquid-liquid(partition)Chromatography,LLC).提出色譜塔板理論;預(yù)測(cè)氣相色譜;提出用細(xì)小顆粒作填料,而兩端可以加壓(HPLC).1952年：馬丁，辛格對(duì)分配層析的研究和發(fā)現(xiàn)，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)羊毛中的氨基酸分離探索與發(fā)現(xiàn)4塔板理論將色譜柱看作一個(gè)分餾塔，待分離組分在分餾塔的塔板間移動(dòng)，在每一個(gè)塔板內(nèi)不同組分分子在固定相和流動(dòng)相之間形成平衡，隨著流動(dòng)相的流動(dòng)，組分分子不斷從一個(gè)塔板移動(dòng)到下一個(gè)塔板，并不斷形成新的平衡分配系數(shù),partitioncoefficient:在平衡狀態(tài)下，組分在固定相中的濃度和在流動(dòng)相中的濃度之比.例:將MgCl2溶解于辛醇和水的混合液體,分別測(cè)量MgCl2在辛醇和水中的濃度,計(jì)算比值.好溶解的分配系數(shù)小,不好溶解的分配系數(shù)大.1952年，馬丁同詹姆斯(James)，把LLC技術(shù)原理應(yīng)用在分離氣體上。各種氣體或蒸汽的混合物利用氮或氦一類(lèi)情性載氣的氣流通過(guò)吸收性固體的表面?；旌系臍怏w通過(guò)后,在另一端出現(xiàn)時(shí)就分開(kāi)了。氣相色譜的產(chǎn)生(GC)探索與發(fā)現(xiàn)5高效液相色譜(HPLC)的應(yīng)用20世紀(jì)60年代以來(lái),氣相色譜作為分析方法已經(jīng)不能滿足對(duì)生物成分分析測(cè)試的要求。高效液相色譜采用了壓力泵及填有很細(xì)的顆粒高效色譜柱。HighPerformanceLiquidChromatography.探索與發(fā)現(xiàn)6液相色譜與氣相色譜法比較

氣相液相對(duì)象氣體,沸點(diǎn)低液相,沸點(diǎn)高固定相固體,固體涂層液固體,固液流動(dòng)相惰性氣體,起運(yùn)載作用液體，與組分可產(chǎn)生親和力環(huán)境高溫常溫應(yīng)用化工分析，環(huán)境生物分子，蛋白核酸，醫(yī)藥層析法的基本原理層析法是利用混合物中各組分物理、化學(xué)性質(zhì)（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等）的差異使各組分在兩相（固定相和流動(dòng)相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。

物理、化學(xué)性質(zhì)（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等）

（1）按流動(dòng)相狀態(tài)分類(lèi)：液相色譜液-固層析液-液層析氣相色譜氣-固層析氣-液層析層析法的分類(lèi)兩種固定相：(固定相不一定是固體)*固體吸附劑作為固定相*吸附在固體上的液體（硅膠吸附的水作固定相，以氯仿作流動(dòng)相，分離羊毛中的氨基酸）（2）按層析原理分類(lèi)：吸附層析：利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能

的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。分配層析：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)（或溶解度）不同。離子交換層析:利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。（3）按操作形式不同分類(lèi)：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，類(lèi)似紙層析。層析技術(shù)第一節(jié)

吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC）√√√第一節(jié)吸附層析技術(shù)吸附柱層析薄層層析聚酰胺薄膜層析疏水層析√√吸附柱層析

吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機(jī)溶劑或緩沖液為流動(dòng)相構(gòu)成柱狀的一種層析方法。常用的吸附劑有羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁、人造沸石和活性炭等。這種層析方法已成為科研、醫(yī)學(xué)、化工及發(fā)酵等部門(mén)常規(guī)使用的一種分離手段。吸附柱層析一、常用術(shù)語(yǔ)1.層析：以基質(zhì)為固定相（柱狀或薄層狀），以液體或氣體為流動(dòng)相，有效成分和雜質(zhì)在這兩個(gè)相中連續(xù)多次地進(jìn)行分配、吸附、交換作用，最終結(jié)果是使混合物得到分離。吸附柱層析一、常用術(shù)語(yǔ)2.洗脫體積（Ve）：是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)的流動(dòng)相體積。第一節(jié)吸附層析技術(shù)吸附柱層析吸附薄層層析聚酰胺薄膜層析疏水層析√薄層層析(TLC)

薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體為流動(dòng)相的一種層析方法。薄層層析可根據(jù)固定相的種類(lèi)分為吸附薄層層析（吸附劑為固定相）、分配薄層層析（固定在支持劑上的水溶液或有機(jī)溶劑為固定相）和離子交換薄層層析（離子交換劑為固定相）等。薄層層析薄層層析的優(yōu)點(diǎn)：1.展層時(shí)間短，薄層層析分離混合物一般僅需15-60min；2.設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，既適用于分析，也適用于制備；3.靈敏度高。薄層層析紙色譜法（分配TLC，纖維結(jié)構(gòu)，固定相是纖維-水）吸附TLC固定相是硅膠，氧化鋁等，層析是依據(jù)吸附力不同第三章層析技術(shù)第一節(jié)吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC)第二節(jié)分配層析技術(shù)分配層析法（液-液層析法，LLC）原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動(dòng)相）之間的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動(dòng)相流過(guò)固定相。分配系數(shù)：當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在流動(dòng)相和固定相兩相內(nèi)的濃度之比是個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)。K=c1/c2分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中的分配的數(shù)量多，移動(dòng)慢；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，移動(dòng)快。因此可彼此分開(kāi)。hH（分配TLC，纖維結(jié)構(gòu)，固定相是纖維-水）紙色譜法第四章層析技術(shù)第一節(jié)吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC)第三節(jié)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)一、基本原理

概念：當(dāng)生物大分子通過(guò)裝有凝膠顆粒的層析柱時(shí)，因分子大小不同而分離。又名分子篩層析。原理：凝膠顆粒為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?；旌衔锪鬟^(guò)時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來(lái)；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過(guò)的路程較長(zhǎng)移動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來(lái)。吸收洗脫體積ml凝膠固定相與流動(dòng)相：凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，流動(dòng)相是流動(dòng)的洗脫液。排阻極限：指不能進(jìn)入凝膠顆粒孔穴內(nèi)部的最小分子的分子量。排阻極限為30000表示30000Da的分子將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來(lái)。3.凝膠顆粒大小

常以目數(shù)(mesh)或者顆粒直徑(mm)來(lái)表示。分辨率和流速都與凝膠顆粒大小有關(guān)。顆粒大，流速快，但分離效果差；顆粒小，分離效果較好，但流速慢。100目~0.250毫米。二、常用概念三、凝膠的種類(lèi)和性質(zhì)

1.交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex)

1)SephadexG(SephadexG-25；SephadexG-50)G后的數(shù)字為凝膠吸水率（單位是ml/g干膠）的10倍。2）SephadexLH-20，是SephadexG-25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。

交聯(lián)葡聚糖凝膠是由葡聚糖和甘油基通過(guò)醚橋交聯(lián)而成的。

2.瓊脂糖凝膠（Sepharose；Bio-Gel)依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。3.Superdex是由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價(jià)結(jié)合而成的。分辨率非常高，化學(xué)物理穩(wěn)定性也很好。

4.聚丙烯酰胺凝膠一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。商品名為生物膠-P（Bio-GelP)。凝膠技術(shù)參數(shù)指標(biāo)凝膠型號(hào)：如SephadexG-10;G-25;粒度范圍：100-200mesh床體積（ml/g）:每克干膠溶漲后的體積有效分離范圍：如1x1031x107工作pH:4-12最大流速：1ml/min最大承受壓力:2MPa三、凝膠的選擇和保存

1.凝膠的選擇

例如樣品中各個(gè)組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，這樣可以很快的達(dá)到分離的目的；如果有個(gè)別組分差別較小，則要考慮使用小顆粒凝膠以提高分辨率。2.凝膠的保存

凝膠的保存一般是反復(fù)洗滌去除蛋白等雜質(zhì)，然后加入適當(dāng)?shù)目咕鷦?，通常加?.02％的疊氮化鈉,或20%酒精,4C下保存。

四、

凝膠過(guò)濾在試驗(yàn)室中的應(yīng)用1）生物大分子物質(zhì)的分離純化2）分子量的測(cè)定3）脫鹽及去除小分子雜質(zhì)4）溶液濃縮5）去熱源物質(zhì)LogMABCLogM測(cè)Ve蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān)，LogM=（k1-k2）Ve

（Ve為洗脫體積）先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)Ve作圖得一直線，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。第四章層析技術(shù)第一節(jié)吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC)一、原理:是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。

第四節(jié)離子交換層析法纖維素—O—CH2—

COO-—Na+圖纖維素陽(yáng)離子交換劑組成示意圖離子交換層析的基本原理示意圖++++———++++++++++—+++二、離子交換基質(zhì)的分類(lèi)及常見(jiàn)種類(lèi)：（一）分類(lèi)陽(yáng)離子交換劑：磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、

羧酸（-COOH）、酚羥基（-OH）等

陰離子交換劑：伯胺（-NH2OH）、仲胺（-NHCH3OH）、

叔胺（-N（CH3）2OH）、季胺（-N（CH3）3OH）等

（二）種類(lèi)1）樹(shù)脂型離子交換劑2）纖維素離子交換劑3）交聯(lián)葡聚糖離子交換劑4）瓊脂糖離子交換劑三、離子交換劑的再生與保存

離子交換劑可在柱上再生也可室內(nèi)瓶裝保存。如離子交換纖維素可用2mol/LNaCl淋洗柱，若有強(qiáng)吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序?yàn)椋?.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時(shí)要加防腐劑。對(duì)陰離子交換劑宜用0.002％洗必泰，陽(yáng)離子交換劑可用0.02％疊氮鈉。四、離子交換層析的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用除去離子（純凈水）聚苯乙烯樹(shù)脂廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面

分離純化改變成分（青霉素-Na＋——青霉素-K＋）濃縮與提?。股亍⒌鞍踪|(zhì)、工業(yè)廢液中微量金屬的提取）離子型化合物分離發(fā)展：自動(dòng)化方向與光譜技術(shù)結(jié)合－專門(mén)用途的綜合性自動(dòng)分析儀與計(jì)算機(jī)相連－進(jìn)行自動(dòng)分析與自動(dòng)控制第四章層析技術(shù)第一節(jié)吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC）原理：

利用生物大分子間特異的親和能力來(lái)純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體等。親和層析包括三個(gè)共價(jià)結(jié)合的組分：不溶性的基質(zhì)（matrix）、一個(gè)間隔臂（spacer）及特異的配基（ligands）第五節(jié)親和層析法目前親和層析技術(shù)主要運(yùn)用在實(shí)驗(yàn)室中

FractionandmonitoringVolumeofeluentAbsorbanceFractions123456789Anactualexampleforgel-filtrationSDSanalysis第四章層析技術(shù)第一節(jié)吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC)第六節(jié)高壓液相層析（HPLC）特點(diǎn)：①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大,因而分辨率很高.（顆粒細(xì)，理論塔板數(shù)多）

②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。（顆粒硬度大、流速快，耐高壓）③重復(fù)性好④色譜柱可以反復(fù)使用⑤自動(dòng)化操作，分析精確度高許多類(lèi)型的柱層析都可用HPLC來(lái)代替，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過(guò)濾等。分類(lèi)

正相色譜法：

共價(jià)結(jié)合到載體上的集團(tuán)都是極性的集團(tuán)，流動(dòng)相的極性比固定相的極性弱。在這種層析過(guò)程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動(dòng)的速度，先從柱中流出來(lái)。

反相色譜法

共價(jià)結(jié)合到載體上的集團(tuán)是一些直鏈碳?xì)浠衔?，流?dòng)相的極性比固定相的極性強(qiáng)。在這種層析過(guò)程中，極性大的分子比極性小的分子移動(dòng)的速度而先從柱中流出。快快一般來(lái)說(shuō)，分離純化極性大的分子（帶電離子等）采用正相色譜（或正相柱），而分離純化極性小的有機(jī)分子（有機(jī)酸、醇、酚等）多采用反相色譜（或反相柱）。

實(shí)踐中，一種物質(zhì)如蛋白的分離純化往往不是單一實(shí)驗(yàn)技術(shù)能夠達(dá)到的。Whatdoesthismean？層析基本原理固相，流動(dòng)相，色譜柱的概念洗脫體積，洗脫曲線的概念凝膠過(guò)濾層析高壓液相層析離子交換層析親和層析吸附層析分配層析(薄層層析)吸附柱層析一、常用術(shù)語(yǔ)1.固定相：是由層析基質(zhì)組成的。其基質(zhì)包括固體物質(zhì)（如吸附劑、離子交換劑）和液體物質(zhì)（如固定在纖維素或硅膠上的溶液），這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆的吸附、溶解和交換作用。2.流動(dòng)相：在層析過(guò)程中推動(dòng)固定相上的物質(zhì)向一定方向移動(dòng)的液體或氣體稱為流動(dòng)相。在柱層析時(shí)，流動(dòng)相又稱洗脫液或洗滌劑。在薄層層析時(shí)流動(dòng)相又稱展層劑。吸附柱層析一、常用術(shù)語(yǔ)2.操作容量：即在特定條件下，某成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量。一般以每克（或毫升）基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)來(lái)表示。其數(shù)值大，表明基質(zhì)對(duì)某種成分的結(jié)合力強(qiáng)，否則反之。吸附柱層析二、基本原理吸附層析法（液-固層析法，LSC）原理：利用固定相的固體吸附劑表面對(duì)不同組分吸附力的大小及洗脫液對(duì)它的溶解度的差異進(jìn)行分離。成分的極性決定于其分子中所含官能基團(tuán)的極性和分子結(jié)構(gòu)，物質(zhì)的極性越大則越容易被固體吸附劑(硅膠或氧化鋁)吸附。特點(diǎn)：適合分離不同種類(lèi)（例如分離醇和芳香烴）的化合物。三、吸附劑1.吸附劑的選擇及預(yù)處理：活性多孔固體，表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)和成本低廉等性能。常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等。羥基羥基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2],可用于分離蛋白質(zhì)、酶、核酸及病毒等生命物質(zhì)。其表面有Ca2+和PO43-兩種帶電基團(tuán)。羥基磷灰石層析在實(shí)驗(yàn)室中最大的用途是分離雙鏈DNA和單鏈DNA。亦可除去混合物中的DNA。三、吸附劑硅膠(Silicagel)：略帶酸性，適用于酸性與中性樣品之分離，堿性樣品容易產(chǎn)生反應(yīng)或拖尾。A.含水量活性硅膠是多孔的、表面含有很多硅醇基團(tuán)（-Si-OH）顆粒狀極性吸附劑。含水量高時(shí)，則結(jié)合力?。ɑ蚧钚孕。.粒度

供層析用的氧化鋁，用于拄層析的，其粒度要求在100～160目之間。粒度大子100目，分離效果差：小于160目，溶濃流速大慢，易使譜帶擴(kuò)散。樣品與氧化鋁的用量比，一般在1：20～50之間層析柱的內(nèi)徑與柱長(zhǎng)比例在1：10-20之向。三、吸附劑活性炭(Silicagel)：是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80℃干燥后即可供層析用。層析用的活性炭，最好選用顆粒活注炭，若為活性炭細(xì)粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流速太慢?；钚蕴恐饕糜诜蛛x水溶性成分，如氨基酸、糖類(lèi)及某些甙?；钚蕴康奈阶饔?，在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機(jī)溶劑則較強(qiáng)。例如以醇-水進(jìn)行洗脫時(shí)，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加?；钚蕴繉?duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，對(duì)大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開(kāi)，單糖與多糖分開(kāi)，氨基酸與多肽分開(kāi)。吸附原理:吸附劑與被吸附物質(zhì)之間的吸引力是范德華力，作用可逆吸附層析的應(yīng)用氨基酸、肽、糖類(lèi)、脂類(lèi)、苷（皂苷）類(lèi)物質(zhì)的分離、鑒定純凈水、醫(yī)藥用水的制備藥液脫色薄層層析一、操作及注意事項(xiàng)：一般層析操作包括薄板制備、點(diǎn)樣、展層、顯色、Rf值測(cè)定和結(jié)果分析等步驟。1.薄層板的制備(1)硅膠的分類(lèi)：硅膠G系含有10%~15%鍛石膏和5%淀粉的硅膠，黏性好；硅膠CMC系含有適量羧甲基纖維素的硅膠；硅膠HF254系含有熒光劑的硅膠H；薄層層析(Thinlayerchromatography)一、操作及注意事項(xiàng)：一般層析操作包括薄板制備、點(diǎn)樣、展層、顯色、Rf值測(cè)定和結(jié)果分析等步驟。1.薄層板的制備(2)硅膠薄層板的制備①玻板：洗凈；20cm20cm；6cm20cm②制板：涂布方法(玻棒涂布法、有機(jī)玻璃尺涂布法、半機(jī)械涂布法)；注意事項(xiàng)：顆粒均勻細(xì)小(>200目)；厚度均一適中(0.25mm-0.5mm-1mm)；2.點(diǎn)樣(<2mm)3.展層4.顯色聚酰胺薄膜層析1966年之后發(fā)展起來(lái)的一種層析方法；特別應(yīng)該指出的是，用此法分析氨基酸衍生物DNP-氨基酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸時(shí)，具有靈敏度高、分辨力強(qiáng)、展層迅速和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)?？捎糜诜宇?lèi)、醌類(lèi)、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸堿基、核苷、核苷酸、雜環(huán)化合物、合成染料、磺胺、抗菌素、環(huán)酮、維生素B和殺蟲(chóng)劑等16類(lèi)化合物。GasChromatographyUsedtodeterminethechemicalcompositionofunknownsubstances,suchasthedifferentcompoundsingasolineshownbyeachseparatepeakinthegraphbelow.LiquidChromatographyUsedtoidentifyunknownplantpigments&othercompounds.ExamplesofChromatographyPaperChromatographyCanbeusedtoseparatethecomponentsofinks,dyes,plantcompounds(chlorophyll),make-up,andmanyothersubstancesThin-LayerChromatographyUsesthinplasticorglasstraystoidentifythecompositionofpigments,chemicals,andotherunknownsubstances.聚酰胺薄膜層析基本原理：聚酰胺對(duì)極性物質(zhì)的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強(qiáng)弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。由己二酸與己二胺聚合而成疏水層析(hydrophobicinteractionchromatography，HIC)疏水層析是根據(jù)分離成分和固定相之間疏水力差異性大小而得到分離。