核酸物理化學(xué)性質(zhì)

Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)一、核酸的水解（一）核酸的酸水解或堿水解核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。DNA和RNA對(duì)酸或堿的耐受程度有很大差別。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA幾乎可以完全水解，生成2′或3′磷酸核苷；DNA在同樣條件下則不受影響。這種水解性能上的差別，與RNA核糖基上2′-OH的鄰基參與作用有很大的關(guān)系。在RNA水解時(shí)，2′-OH首先進(jìn)攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時(shí)形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。

DNA一般對(duì)堿穩(wěn)定，RNA對(duì)堿不穩(wěn)定。第1頁(yè)/共17頁(yè)（二）核酸的酶水解一、核酸的水解生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶。這些酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵。以DNA為底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA為底物的RNA水解酶（RNases）。根據(jù)作用方式又分作兩類：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3′端或5′端）開始，逐個(gè)水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個(gè)位點(diǎn)切斷磷酸二酯鍵。在分子生物學(xué)研究中最有應(yīng)用價(jià)值的是限制性核酸內(nèi)切酶。這種酶可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)第2頁(yè)/共17頁(yè)Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)一、核酸的水解（二）核酸的酶水解脫氧核糖核酸酶類1、牛胰脫氧核糖核酸酶(DNaseI)：從5′磷酸末端切下寡聚核苷酸。2、牛脾脫氧核糖核酸酶(DNaseII)

：從5′磷酸末端切下寡聚核苷酸。3、限制性內(nèi)切酶：存在于細(xì)菌體內(nèi)，用于專一性地降解外源的DNA，限制性內(nèi)切酶已成為基因工程最重要的工具酶。如EcoRI

（請(qǐng)看教材503—504頁(yè)）第3頁(yè)/共17頁(yè)二、核酸的分子量、溶解性、粘度和酸堿性質(zhì)Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)1、分子量在數(shù)百至數(shù)百萬(wàn)之間；微溶于水，不溶于有機(jī)溶劑；變性時(shí)粘度降低；2、核酸的堿基、核苷和核苷酸均能發(fā)生解離。在一定的條件下可形成兼性離子，為兩性電解質(zhì)，具有等電點(diǎn)。第4頁(yè)/共17頁(yè)Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)三、核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨(dú)特的紫外線吸收光譜，最大吸收峰波長(zhǎng)（λmax）在260nm處，可以作為核酸及其組份定性和定量測(cè)定的依據(jù)。第5頁(yè)/共17頁(yè)Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)三、核酸的紫外吸收摩爾磷消光系數(shù)508頁(yè)

增色效應(yīng)：核酸發(fā)生變性時(shí)，摩爾磷消光系數(shù)增加的現(xiàn)象。減色效應(yīng)：復(fù)性后，摩爾磷消光系數(shù)又降低的效應(yīng)。第6頁(yè)/共17頁(yè)Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)四、核酸的變性、復(fù)性及分子雜交(一)核酸的變性(denaturation)核酸的變性:維系核酸三維結(jié)構(gòu)的堿基堆積力和氫鍵如果受到某些理化因素的破壞，其三維結(jié)構(gòu)就要改變，從而引起理化性質(zhì)及生物學(xué)功能的改變，這種現(xiàn)象稱為核酸的變性。變性核酸將失去其部分或全部的生物活性。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿度改變、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的變性。

變性與降解的區(qū)別：是否涉及共價(jià)鍵的斷裂和分子量的改變。第7頁(yè)/共17頁(yè)第8頁(yè)/共17頁(yè)Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)四、核酸的變性、復(fù)性及分子雜交核酸的變性的特征DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將引起DNA變性的溫度稱為融點(diǎn)，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)。G和C的含量高，Tm值高。因而測(cè)定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通過經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44

影響DNATm大小的因素：DNA的均一性；G—C的含量；介質(zhì)中的離子強(qiáng)度。第9頁(yè)/共17頁(yè)Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)四、核酸的變性、復(fù)性及分子雜交當(dāng)DNA的稀鹽溶液加熱到80-100℃時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)即發(fā)生解體，兩條鏈彼此分開，形成無(wú)規(guī)線團(tuán)。DNA變性后，它的一系列性質(zhì)也隨之發(fā)生變化，如紫外吸收(260nm)值升高,粘度降低等。第10頁(yè)/共17頁(yè)Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)四、核酸的變性、復(fù)性及分子雜交(二)核酸的復(fù)性(renaturation)核酸的復(fù)性:變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過程的條件有關(guān)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性。分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。此外，DNA的復(fù)性也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。第11頁(yè)/共17頁(yè)(二)核酸的復(fù)性(renaturation)第12頁(yè)/共17頁(yè)Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)四、核酸的變性、復(fù)性及分子雜交(三)核酸的雜交(hybridization)熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時(shí)并不一定與同源DNA互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，叫核酸雜交。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。DNA單鏈與互補(bǔ)的RNA鏈之間也可以發(fā)生雜交。核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。Southernblotting（Southern印跡法）：DNA-DNA雜交Northernblotting（Northern印跡法）：DNA-RNA雜交Westernblotting（Western印跡法）：抗原-抗體結(jié)合510頁(yè)第13頁(yè)/共17頁(yè)(三)核酸的雜交第14頁(yè)/共17頁(yè)五、核酸的沉降特性Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)

超速離心法純化核酸。分離DNA常用氯化銫密度梯度；分離RNA常用蔗糖密度梯度；應(yīng)用啡啶嗅紅-氯化銫密度梯度平衡超離心可將不同構(gòu)象的DNA、RNA及蛋白質(zhì)分開，是實(shí)驗(yàn)室最常用的純化質(zhì)粒DNA的方法請(qǐng)看515頁(yè)第15頁(yè)/共17頁(yè)Chapter13核酸的物理化學(xué)性質(zhì)六、核酸的凝膠電泳1、瓊脂糖凝膠電泳：分析分子量大于1000bp的DNA片段請(qǐng)看516頁(yè)2、聚丙烯酰胺凝膠電泳：分析分子量小于1000bp的DNA片段第16頁(yè)/共17頁(yè)七、DNA的固相合成520頁(yè)八、DNA的限制酶圖譜限制性內(nèi)切酶

來源于細(xì)菌，高度專一地識(shí)別外源DNA上的特定位點(diǎn)，并將其切斷，形成形成粘性末端或平齊末端