實(shí)驗(yàn)四尿標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)四尿標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)第一頁，共四十六頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆漳蛞簶?biāo)本的采集與處理、常見病原菌及一般微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和細(xì)菌計(jì)數(shù)方法。掌握大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌的微生物學(xué)鑒定方法和生物學(xué)性狀。第二頁，共四十六頁，2022年，8月28日尿標(biāo)本的采集與處理：正常人的尿液通常是無菌的，但在外尿道除有正常菌群外，尚有其他一些病原菌和條件致病菌，可通過多種途徑引起尿路感染（urinarytractinfection,UTI）。如：葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌、大腸埃希氏菌、變形桿菌等。標(biāo)本采集方法常有五種：導(dǎo)尿法、中段尿采集法、腎盂尿采集法、膀胱穿刺采集法、留尿法。第三頁，共四十六頁，2022年，8月28日1）導(dǎo)尿法：采取導(dǎo)尿管導(dǎo)尿，是一種較好的無菌采集法，可直接插導(dǎo)管采集尿液標(biāo)本或滯留導(dǎo)管集尿。直接導(dǎo)尿先讓尿流棄15ml，滯留導(dǎo)管集尿先用70%酒精消毒導(dǎo)管口再用針筒抽取，取尿量為10～15ml，直接導(dǎo)尿有將尿道細(xì)菌進(jìn)入膀胱的危險(xiǎn)，盡量避免此方法。2）中段尿采集法：目前國內(nèi)臨床常用此法。女性病人先用肥皂水或1:1000高錳酸鉀水溶液沖洗外陰及尿道口；男性病人應(yīng)翻轉(zhuǎn)包皮沖洗，用1:1000新潔爾滅消毒尿道口；用無菌生理鹽水或無菌水沖去消毒液，再用滅菌紗布擦干，讓病人排尿，棄去前段尿，收集中段尿10～20ml，置于無菌容器內(nèi)，立即加蓋送檢。第四頁，共四十六頁，2022年，8月28日3）腎盂尿采集法：由泌尿科醫(yī)生在膀胱鏡下分別采集左右側(cè)輸尿管的尿液，并做好標(biāo)記，以防左右側(cè)錯(cuò)位，尿液采集量不少于1ml。4）膀胱穿刺采集法：在病人恥骨上膀胱區(qū)用碘酒、酒精消毒（要求病人不排尿充盈膀胱）以無菌針筒做膀胱穿刺，抽取尿液后針筒插入橡皮塞送檢。此法主要用于厭氧培養(yǎng)。5）留尿法：疑為尿道結(jié)核患者，可用一潔凈容器，留取24h尿液，取其沉淀部分盛于清潔瓶內(nèi)送檢。第五頁，共四十六頁，2022年，8月28日通常取晨起第一次尿送檢。由于治療所用藥物多數(shù)均通過尿液排泄，因此，無論用何種方法采集尿液都宜在用藥前進(jìn)行。尿液標(biāo)本的采取和培養(yǎng)最大的問題是污染雜菌，故應(yīng)嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作尿液標(biāo)本中不得加防腐劑，否則會(huì)影響檢出的陽性率。尿液標(biāo)本采集后要立即送檢（常規(guī)2h內(nèi)）或存放于4℃冰箱（不超過24h，教材規(guī)定為8h），因擱置時(shí)間稍長尿中病原菌可在室溫中增殖，而影響細(xì)菌計(jì)數(shù)的正確性。應(yīng)注意淋病奈瑟菌培養(yǎng)時(shí)標(biāo)本不能冷藏保存。第六頁，共四十六頁，2022年，8月28日常見病原菌：

醫(yī)院內(nèi)引起UTI的病原菌70%為革蘭氏陰性桿菌，其中以腸桿菌科和假單胞菌屬的細(xì)菌為主；革蘭氏陽性菌約占20%，其中以葡萄球菌和腸球菌為多見。由于抗菌素的廣泛應(yīng)用，近年來真菌性UTI增多，約占10%。第七頁，共四十六頁，2022年，8月28日檢驗(yàn)程序：

尿標(biāo)本直接涂片染色分離培養(yǎng)

細(xì)菌計(jì)數(shù)直接藥敏試驗(yàn)（特殊細(xì)菌檢查離心沉淀）BA、中國藍(lán)或麥康凱平板（常規(guī)培養(yǎng)）血清學(xué)鑒定生化鑒定藥敏試驗(yàn)確定病原菌定量培養(yǎng)直接計(jì)數(shù)35℃18～24h觀察菌落形態(tài)、涂片染色鏡檢發(fā)報(bào)告第八頁，共四十六頁，2022年，8月28日檢驗(yàn)程序：革蘭陰性桿菌

氧化酶（Oxi）-+腸桿菌科細(xì)菌非發(fā)酵菌

氧化酶陰性非發(fā)酵菌：不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌。氧化酶陽性其他革蘭陰性菌：巴斯德菌、氣單胞菌、鄰單胞菌

和弧菌屬等也是氧化酶陽性。第九頁，共四十六頁，2022年，8月28日麥康凱平板（Mac）：

是一種腸道桿菌專用的弱選擇性培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成分中除基礎(chǔ)成分外，主要含有0.5%膽鹽、1%乳糖、中性紅指示劑。

膽鹽：一方面對沙門氏菌有刺激生長作用，另一方面對革蘭氏陽性菌及大腸埃希氏菌有抑制作用。

1%乳糖：作為一種指示糖。

中性紅指示劑：pH6.8—8.4，由紅—黃。（分解乳糖的細(xì)菌產(chǎn)酸，使菌落周圍膽鹽堆積變渾濁）第十頁，共四十六頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)器材：1、標(biāo)本：1#、2#、3#模擬尿液標(biāo)本。2、培養(yǎng)基：BA、Mac、普通營養(yǎng)瓊脂、KIA、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽斜面、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸鹽蛋白胨水。3、試劑：9.9ml無菌生理鹽水、革蘭染液、氧化酶試劑、3%H2O2、靛基質(zhì)試劑、甲基紅試劑、VP甲液、VP乙液、10%FeCl3、硝酸鹽還原試劑甲液、硝酸鹽還原試劑乙液。4、其它：無菌空平皿、載玻片等。第十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)方法：一、分離培養(yǎng)

用無菌方法將1#、2#、3#模擬尿液標(biāo)本分別劃線接種于BA、Mac上，置35℃培養(yǎng)18—24小時(shí)。二、直接涂片染色

取上述1#、2#、3#標(biāo)本分別作涂片、革蘭氏染色、鏡檢。（要求繪圖并描述）三、細(xì)菌計(jì)數(shù)（傾注平板法）0.1ml尿液9.9ml無菌NS混勻

取0.1ml（1:1000稀釋）標(biāo)本

無菌空平皿傾入10～15ml加熱融化并冷至50℃±的無菌營養(yǎng)瓊脂，混勻35℃培養(yǎng)18～24h。第十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日0.1ml尿液9.9mlNS1:100稀釋標(biāo)本0.1ml總稀釋倍數(shù)1:1000第十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日四、結(jié)果觀察：1、細(xì)菌計(jì)數(shù)

1）結(jié)果記錄：

2）結(jié)果計(jì)算：每ml尿液細(xì)菌數(shù)=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)

3）結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：

尿標(biāo)本中細(xì)菌的計(jì)數(shù)，主要是根據(jù)尿中細(xì)菌的多少來判斷是否感染。一般認(rèn)為，細(xì)菌計(jì)數(shù)：＜104/ml為污染

＞105/ml為感染104~105/ml為可疑

第十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日

目前認(rèn)為由革蘭氏陰性桿菌引起的菌尿，其菌數(shù)均可達(dá)到＞105/ml，而球菌所引起的菌尿，其菌數(shù)達(dá)到104/ml，即可作為尿路感染的標(biāo)準(zhǔn)（因不同細(xì)菌繁殖速度快慢不一，在同一時(shí)間內(nèi)細(xì)菌繁殖數(shù)應(yīng)該是：革蘭氏陰性桿菌＞葡萄球菌＞腸球菌）。為此，作菌尿計(jì)數(shù)時(shí)，必須與涂片染色結(jié)果結(jié)合，作出報(bào)告。

以下幾種情況均可使尿液中菌數(shù)＜104/ml：

（1）應(yīng)用了低敏感性抗菌藥物，尿液中細(xì)菌受到一定抑制。（2）

患者大量輸液或使用利尿劑后。

（3）尿液pH值失常，當(dāng)pH＜5.8或pH＞8.5時(shí)，細(xì)菌生長受阻。（4）尿頻時(shí)，膀胱內(nèi)的菌停留時(shí)間短則細(xì)菌數(shù)少。（5）某些菌的繁殖能力低。第十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日2、菌落形態(tài)描述：（BA、Mac分別描述）1#標(biāo)本：2#標(biāo)本：3#標(biāo)本：3、菌體形態(tài)觀察：

分別取1#、2#、3#標(biāo)本的BA、Mac培養(yǎng)物涂片、革蘭染色、鏡檢。（要求繪圖并描述、對比BA、Mac菌體形態(tài)差異）

BA：Mac：第十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日五、鑒別試驗(yàn):1、氧化酶（Oxidase）試驗(yàn)：原理：

氧化酶又稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。氧化酶試驗(yàn)中，酶并不直接與試劑（1%鹽酸四甲基對苯二胺或1%鹽酸二甲基對苯二胺）起反應(yīng)，而是首先使細(xì)胞色素c氧化，然后氧化型細(xì)胞色素c使對苯二胺氧化，出現(xiàn)顯色反應(yīng)。試劑：1％鹽酸四甲基對苯二胺或

1％鹽酸二甲基對苯二胺方法：直接法和試劑紙片法

直接法：用濾紙片刮取待檢菌菌落（切勿刮到培養(yǎng)基），在有菌的位置滴加氧化酶試劑，1分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：立即出現(xiàn)紅色，繼而逐漸加深為陽性（鹽酸四甲基對苯二胺呈現(xiàn)藍(lán)紫色為陽性），不變色為陰性。第十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日意義：

本試驗(yàn)應(yīng)用廣泛，如奈瑟菌屬、假單胞菌屬、莫拉菌屬呈陽性，腸桿菌科細(xì)菌呈陰性。2、觸酶試驗(yàn)：第十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日六、生化鑒定：將1#、2#、3#標(biāo)本分別接種于KIA、、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽斜面、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸鹽蛋白胨水中，置35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。第十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日1、KIA（克氏雙糖鐵）試驗(yàn)：原理1、營養(yǎng)非常豐富2、葡萄糖：乳糖＝1：103、指示劑為酚紅：變色范圍6.0～8.6，

pH<6.0黃色，pH>8.6顯紅色4、含有硫代硫酸鈉5、含有Fe2＋方法：直接觀察結(jié)果。第二十頁，共四十六頁，2022年，8月28日21只分解葡萄糖分解葡萄糖和乳糖產(chǎn)生氣體產(chǎn)生H2S

結(jié)果判斷第二十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日22第二十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日結(jié)果表示：

不產(chǎn)酸－，產(chǎn)酸＋，產(chǎn)酸產(chǎn)氣⊕產(chǎn)酸A,產(chǎn)堿K

斜面/底層H2S斜面/底層H2S產(chǎn)氣

＋/⊕－

A/

A

－

＋

－/⊕＋K/

A

＋＋第二十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日242、吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn):原理：色氨酸色氨酸酶吲哚、丙酮酸和氨對二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚吲哚＋第二十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日25方法:結(jié)果:

應(yīng)用：用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。第二十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日263、甲基紅試驗(yàn)（MR試驗(yàn)）

4、VP試驗(yàn)

第二十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日27原理：變色范圍4.4～6.2第二十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日28方法及結(jié)果：第二十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日29甲基紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性陽性第二十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日30VP實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性陰性第三十頁，共四十六頁，2022年，8月28日31應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。

MRVP

大腸埃希菌

＋

－產(chǎn)氣腸桿菌

－

＋

第三十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日32※

IMViCI:吲哚試驗(yàn)M:甲基紅試驗(yàn)V:V-P試驗(yàn)C:枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)

第三十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日33

5、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)

原理：

某些細(xì)菌能利用培養(yǎng)基中的枸櫞酸鈉作為唯一的碳源而獲得能量，能利用枸櫞酸鹽的細(xì)菌也能利用銨鹽作為唯一氮源，同時(shí)產(chǎn)生氨。分解枸櫞酸鹽使培養(yǎng)基變堿性。方法：直接觀察結(jié)果。應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌的鑒定第三十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日34第三十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日356、尿素酶試驗(yàn)

原理：產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌，分解培養(yǎng)基中的尿素，產(chǎn)生碳酸銨是培養(yǎng)基pH，酚紅由淺紅色變成深紅色。第三十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日36方法：直接觀察結(jié)果。

結(jié)果：反應(yīng)時(shí)間因細(xì)菌而異。培養(yǎng)基變成深紅色為陽性。

應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。第三十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日377、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)：

原理：第三十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日38方法：待檢菌大量接種于苯丙氨酸瓊脂斜面上，培養(yǎng)后在斜面上直接加4～5滴10％氯化鐵試劑，出現(xiàn)綠色為陽性，立即觀察，為可逆反應(yīng)。第三十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日39第三十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日408、硝酸鹽還原試驗(yàn)：原理：有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾取喯跛猁}與硝酸鹽還原試劑中的醋酸作用生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中對氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸與α-萘胺結(jié)合成紅色的N-α-萘胺偶氮苯磺酸。方法：在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)物中分別滴加硝酸鹽還原試劑甲液和乙液各1～2滴，混勻，立即觀察結(jié)果。

第四十頁，共四十六頁，2022年，8月28日41陽性：加入試劑后30s變成紅色，表明有亞硝酸鹽存在，表示硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性。陰性：加入試劑后沒有顏色反應(yīng)，可能是：①硝酸鹽沒有被還原(真陰性反應(yīng))；②硝酸鹽被還原成非亞硝酸鹽的其他產(chǎn)物，如NH3、N2(脫硝作用)、NO或N2O