臨床免疫學檢驗：10 免疫細胞功能檢測

第十三章免疫細胞分離與免疫細胞功能檢測

P134免疫細胞分離技術(shù)外周血單個核細胞分離---密度梯度離心法

原理：不同血細胞由于體積、形態(tài)、比重的不同，將其置于同一種離心力作用下，經(jīng)過一定時間離心，它們就會分在不同的層次中。紅細胞和粒細胞比重為1.092左右；淋巴細胞和單核細胞（統(tǒng)稱為單個核細胞PBMC）比重為1.075~，為此，利用比重介于二者之間的淋巴細胞分離液（1.077±0.001）做密度梯度離心，可將單個核細胞分離出來。

常用的分離液－淋巴細胞分離液由聚蔗糖（Ficoll)和泛影葡胺（Hypaque)組成，故又稱為Ficoll-Hypaque分離液或Ficoll分離液。

Ficoll液的比重為1.077±0.001。稀釋血淋巴細胞分離液血漿+Hanks液淋巴細胞分離液RBC+粒細胞單個核細胞離心20分鐘2000轉(zhuǎn)

Ficoll液密度梯度離心分離單個核細胞示意圖密度梯度離心法分離單個核細胞T/B細胞及T細胞亞群的分離---

免疫磁珠法原理：基于細胞表面Ag與連接有磁珠的特異性McAb結(jié)合，形成細胞-Ab-磁珠復合物，與磁珠相連的細胞在外加磁場作用下被吸附而滯留于磁場；而無該種表面Ag的細胞由于不能與連接有磁珠的特異性McAb結(jié)合而沒有磁性，不能在磁場停留，從而使細胞分離。免疫磁珠分離細胞原理示意圖

淋巴細胞功能檢測

一.非特異性免疫應答（固有性免疫應答，innateimmuneresponse)（一）概念

：人類在種系發(fā)展過程中形成的并可遺傳給后代的免疫力，它是天生具有的，不專門針對某種Ag物質(zhì)。（二）特點：

1.先天獲得，人人皆有；比較穩(wěn)定，并可遺傳給下一代

2.不因同一抗原進入機體次數(shù)多少改變反應強弱

3.發(fā)揮作用迅速

免疫應答的類型及組成分兩種類型一.非特異性免疫應答二.特異性免疫應答（三）組成1.皮膚、黏膜的機械阻擋作用及局部分泌的抑菌、殺菌物質(zhì)2.吞噬細胞的吞噬作用3.NK(naturekiller)細胞對病毒感染靶細胞的殺傷作用4.血液、體液中的抗菌分子：補體、溶菌酶二.特異性免疫應答（適應性免疫應答，adaptiveimmuneresponse)（一）概念：具有特異性，即針對某一特定的Ag物質(zhì)而發(fā)生反應，包括細胞免疫和體液免疫（二）特點：

1.后天獲得

2.有明顯的個體差異

3.免疫發(fā)生強弱與抗原進入次數(shù)有關(guān)（三）組成細胞免疫：由TLC主導完成，其效應物質(zhì)是致敏TLC(CTL/Th1)體液免疫：由BLC主導完成，其效應物質(zhì)是Ab第二節(jié)人體免疫功能檢測非特異免疫功能體液中殺菌物質(zhì)——補體、溶菌酶吞噬細胞——大、小吞噬細胞（數(shù)量、功能）

特異性免疫功能細胞免疫功能T細胞數(shù)量功能體液免疫功能B細胞數(shù)量功能人特異免疫功能的檢測一.T細胞數(shù)量的檢測二.T細胞功能的檢測三.B細胞數(shù)量的檢測四.B細胞功能的檢測一.T細胞的計數(shù)（T細胞表面標志的檢測）（一）特異性抗原的檢測

淋巴細胞表面有一些特異的CD抗原，根據(jù)不同的CD抗原可鑒定出不同的細胞群體CD抗原：淋巴細胞群（簇）分化抗原：不同群淋巴細胞在分化成熟過程中，細胞表面出現(xiàn)或消失的抗原分子T細胞表面主要CD抗原及其特異性

CD抗原特異性

CD2

E受體、全部T細胞和部分NK細胞

CD3

成熟T細胞

CD4

Th（輔助）細胞、M、HIV受體

CD8

Tc（殺傷）細胞、NK細胞的亞型

CD25活化T細胞、IL-2受體

檢測T淋巴細胞表面CD抗原中:CD3+的數(shù)量表示成熟的總T淋巴細胞的數(shù)量CD4+的數(shù)量表示是Th細胞的數(shù)量CD8+的數(shù)量表示是Ts/CTL細胞的數(shù)量CD4+/CD8+≥1.5免疫功能差或者免疫功能紊亂，該比值往往小于1。檢測方法：

用已標記的抗CD抗原的單克隆抗體檢測1.免疫熒光法：用熒光素標記的單抗作為試劑染色淋巴細胞，計算出染上熒光的淋巴細胞百分率如：熒光標記的抗CD4單抗

淋巴細胞

染上熒光的為CD4+細胞

染色2.免疫細胞化學法：

用酶標記的單抗檢測淋巴細胞

淋巴細胞印片

淋巴細胞，淋巴細胞表面CD抗原與相應單抗結(jié)合

加底物細胞上有顏色即為陽性細胞

用酶標記的單抗洗滌染色（二）T細胞特異性受體（E受體）的檢測

E花環(huán)形成試驗(ErythrocyteRosetteformingtest)原理：

T淋巴細胞表面含有綿羊紅細胞（SRBC)受體（CD2)，當T淋巴細胞與綿羊紅細胞相遇時，T細胞通過該受體吸附綿羊紅細胞而形成花環(huán)。

E:erythrocyte,紅細胞E花環(huán)形成試驗據(jù)實驗條件不同又分兩種：

Et花環(huán)形成試驗（total,總E花環(huán)）

Ea花環(huán)形成試驗（active,活性E花環(huán)）1.Et花環(huán)形成試驗淋巴細胞+SRBC(1:50~100)37°C

、5min低速離心4°C、2h

計數(shù)形成花環(huán)百分率意義：代表T細胞總數(shù)（凡是T細胞均能形成花環(huán)），數(shù)量低于正常，說明細胞免疫功能差。

正常值：60%~80%2.Ea花環(huán)形成試驗淋巴細胞+SRBC(1:8-20)37C、5min低速離心4°C、10min

計數(shù)形成花環(huán)百分率意義：能形成Ea花環(huán)的T細胞是活性強的T細胞，Ea花環(huán)形成率更能反映細胞免疫功能。正常值：20%~30%

二.T細胞功能的檢測

檢測T細胞功能的試驗有：（一）T細胞增殖轉(zhuǎn)化試驗（二）T細胞分泌功能測定（細胞因子檢測）（三）T細胞介導的細胞毒性檢測（一）T細胞增殖轉(zhuǎn)化試驗1.原理

淋巴細胞在某些物質(zhì)刺激下，細胞增殖、分化（如細胞變大、胞漿增多、出現(xiàn)空泡）DNA合成增加（核染色質(zhì)疏松，核仁出現(xiàn)），轉(zhuǎn)化成為淋巴母細胞。

2.刺激物

一般分有絲分裂原（非抗原）和抗原兩類：（1）非抗原刺激物（有絲分裂原）可刺激相關(guān)淋巴細胞發(fā)生增殖轉(zhuǎn)化，與機體是否曾受過某一抗原致敏無關(guān)。

非抗原刺激物

刺激物能刺激發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞

植物血凝素（PHA)T

刀豆素A(ConA)T

脂多糖(LPS)、SPAB

商陸絲裂原(PWM)T、B（2）抗原刺激物

只能使曾經(jīng)被相應抗原刺激（致敏）過的淋巴細胞發(fā)生增殖轉(zhuǎn)化。3.試驗方法（1）形態(tài)學檢測法

抽取待測者血，加入PHA進行培養(yǎng)，3天后涂片染色，計數(shù)100個LC中轉(zhuǎn)化的淋巴細胞即淋巴母細胞（根據(jù)形態(tài)）百分率。正常值60%～80%操作過程：試驗管:抗凝血2-3ml+PHA2mg+培養(yǎng)液對照管：抗凝血+培養(yǎng)液37°C

5%co2培養(yǎng)3天涂片染色計數(shù)100個LC中轉(zhuǎn)化淋巴細胞的百分率轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化淋巴細胞的區(qū)別轉(zhuǎn)化細胞未轉(zhuǎn)化細胞特點母細胞過渡型小淋巴細胞細胞大?。ㄖ睆剑?2~20μ12~16μ6~8μ

胞核染色質(zhì)疏松疏松致密核仁1~3個有或無無分裂相有或無無無量豐富稍寬窄嗜堿性強、深蘭色蘭色天青蘭空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無

胞漿形態(tài)學方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：操作簡便、不需特殊儀器，無有害物質(zhì)（放射性物質(zhì)）污染。缺點：判斷結(jié)果不客觀，受主觀因素影響，結(jié)果判斷難以規(guī)范化。（2）同位素摻入法（

3H-TdR摻入法）原理：

T細胞受PHA刺激后，細胞進入增殖期發(fā)生有絲分裂合成DNA。實驗中當細胞進入S期時，在培養(yǎng)液中加入3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR)，細胞攝入合成DNA，根據(jù)摻入細胞內(nèi)的同位素量，可推測細胞增殖轉(zhuǎn)化程度。步驟：外周血分離淋巴細胞洗滌3次計數(shù)并配成1×106/ml0.1ml細胞+16400.1ml+PHA0.5mg/ml37°C

54-56h5%co2加3H-TdR1μci/孔37°C

16-18h5%co2收集細胞于濾膜上80~85°C

30min置有閃爍液的閃爍瓶中用閃爍計數(shù)儀測cpm（每分鐘脈沖數(shù)）結(jié)果：計算刺激指數(shù)刺激指數(shù)(SI)=

實驗組cpm對照組cpm正常值：SI3.0同位素摻入法的優(yōu)缺點優(yōu)點：結(jié)果客觀準確，有取代形態(tài)學法的趨勢缺點：技術(shù)要求高，操作中每個因素的改變都可影響實驗結(jié)果；需要特殊儀器檢測；存在同位素污染問題（3）MTT比色法

MTT—四甲基偶氮唑鹽

淋巴細胞受PHA刺激培養(yǎng)中，細胞增殖活躍，在細胞培養(yǎng)終止前4~6h（66-68h)加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)。

原理：MTT在細胞線粒體琥珀酸脫氫酶的作用下，被還原成藍黑色的MTT-甲瓚顆粒，形成的MTT-甲瓚量與細胞增殖程度呈正相關(guān)。終止培養(yǎng)后加入二甲亞砜，使其溶解。在酶標儀上測A570nm，可反映細胞增殖水平。結(jié)果：以刺激指數(shù)SI判斷淋巴細胞增殖程度。

SI=試驗孔A570nm/對照孔A570nm本法敏感性不及3H-TdR摻入法，但操作簡單，無放射性污染。（二）T細胞介導的細胞毒試驗

細胞毒性T細胞（CTL)具有殺傷靶細胞的功能，它是評價機體細胞免疫水平的指標。檢測該殺傷作用的試驗稱為細胞毒試驗。CTL與靶細胞表面相應抗原結(jié)合通過脫顆粒，釋放穿孔素、顆粒酶；FasL/Fas介導，使靶細胞溶解、凋亡。CTLCD8+靶細胞穿孔素、顆粒酶FasL/Fas介導靶細胞溶解、凋亡致敏淋巴細胞CTL殺傷靶細胞的顆粒外排途徑和Fas-FasL途徑聯(lián)合殺傷靶細胞的過程CTL殺傷具有高度的抗原特異性及嚴格的MHC限制性CTL連續(xù)殺傷靶細胞

CTL的殺傷特點：抗原特異性、MHC限制性、高效性與連續(xù)性

方法1.形態(tài)學檢測法

淋巴細胞與靶細胞按一定比例加在一起培養(yǎng)一定時間，染色后計數(shù)殘留靶細胞（腫瘤細胞）數(shù)，計算淋巴細胞抑制腫瘤細胞生長的抑制率。對照組（不加LC，只有腫瘤細胞）：對照組平均殘留腫瘤細胞數(shù)實驗組（LC+腫瘤細胞）：實驗組平均殘留腫瘤細胞數(shù)抑制率%=對照組-實驗組對照組100%2.同位素法：常用51Cr釋放試驗原理：用51Cr標記靶細胞（一般為腫瘤細胞），將它與待測淋巴細胞（效應CTL細胞）一起培養(yǎng)，效應細胞破壞靶細胞，51Cr釋放出來，測定釋放的51Cr數(shù)量，便可推知效應細胞的殺傷能力。方法：效應細胞：受檢者外周血單個核細胞靶細胞：用鉻酸鈉（Na251Cr)標記傳代腫瘤細胞分三組：1.最大釋放組：50μl靶C+150μlDW(靶細胞全溶)2.自發(fā)釋放組：50μl靶C+150μl培養(yǎng)液3.實驗組：50μl靶C+150μl培養(yǎng)液+100μl效應C效：靶分別為100：1；50：1；25：1培養(yǎng)后取上清測cpm計算特異溶解百分率：實驗組cpm-自發(fā)釋放組cpm

最大釋放組cpm-自發(fā)釋放組cpm100%特異溶解百分率大于50%為陽性細胞免疫功能體內(nèi)檢測法（體內(nèi)試驗）

—Ⅳ型超敏反應皮試原理：Ⅳ型超敏反應的本質(zhì)是細胞免疫，因此Ⅳ型超敏反應為陽性，可反映機體細胞免疫功能好。1.特異性抗原皮膚試驗：所用Ag:OT或PPD以O(shè)T為例：OT1:20000.1ml皮內(nèi)注射，48—72h觀察結(jié)果，紅腫硬結(jié)直徑大于0.5cm為陽性

該試驗設(shè)計是基于人群中96%的人均感染過結(jié)核菌（被結(jié)核抗原致敏），致敏淋巴細胞再次接觸抗原（如OT)后，釋放細胞因子，使局部產(chǎn)生以巨噬細胞、淋巴細胞浸潤為主的炎癥反應（表面為紅腫硬結(jié)）。陽性（直徑>0.5cm)：表明曾感染過結(jié)核菌，細胞免疫功能好陰性(直徑<0.5cm)

：表明細胞免疫功能差或從未感染過結(jié)核菌強陽性（直徑>2.5cm)：表明現(xiàn)處于結(jié)核的活動期

2.PHA皮膚試驗：

將定量PHA注射到受試者前臂皮內(nèi)，6~12h后出現(xiàn)紅斑和硬結(jié)，24~48h達高峰，直徑>15mm為陽性反應。

該法敏感性高，安全可靠。

三.B細胞數(shù)量的檢測（一）B細胞表面識別抗原受體（BCR）（SmIg,SurfacemembraneIg)的檢測1.SmIg是B細胞表面膜免疫球蛋白，存在于成熟B淋巴細胞膜上，為B細胞結(jié)構(gòu)蛋白。類型為：IgM、IgD型。作用及意義：

a.是B細胞的表面標志

b.是B細胞識別抗原的受體

c.檢測外周血淋巴細胞時，表面有SmIg者為B細胞，故可作為檢測B細胞數(shù)量的方法。2.方法（常用免疫熒光法）（1）試劑：熒光標記的抗人IgM、IgD抗體（2）外周血淋巴細胞涂片，熒光抗體染色（3）觀察：陽性細胞呈均染上熒光3.正常值：15%~25%（二）B細胞表面抗原的檢測

B細胞表面特有的CD抗原有：CD19、CD20、CD21等。B細胞亞群：B1群（CD19+、CD5+）

B2群（CD19+、CD5-

）用抗CD21的單抗（免疫熒光法、酶免疫組化法）檢測外周血淋巴細胞，陽性細胞為B淋巴細胞，約占總淋巴細胞的10%~15%。

四.B細胞功能的檢測（一）血清中Ig的測定

檢測人免疫球蛋白常用方法單向瓊脂擴散實驗、免疫比濁法正常值：IgG12g/L(7.6~16.6)

IgM1.3g/L(0.4~2.2)