新型有機酸的發(fā)酵法制備技術

李江華江南大學2014-9-19新型有機酸的發(fā)酵法制備技術報告內(nèi)容

一.新型有機酸概況二.新型有機酸發(fā)酵研究進展舉例丙酮酸發(fā)酵丙酸發(fā)酵

α-酮戊二酸發(fā)酵三.新型有機酸發(fā)酵工業(yè)展望一、新型有機酸概況

新型有機酸概述檸檬酸乳酸α-酮戊二酸丙酸琥珀酸衣康酸葡萄糖酸丙酮酸有機酸是指一些具有酸性的有機化合物。最常見的有機酸是羧酸，其酸性源于羧基

(-COOH)新型有機酸概述新型有機酸是指一系列在食品、醫(yī)藥和化工等領域具有重要應用價值，但是長期以來由于結構復雜性和較高的化學反應活性無法在工業(yè)規(guī)模進行低成本生產(chǎn)的有機酸。其中丙酮酸、-酮戊二酸和丙酸等，由于化學合成工藝復雜，成本長期維持在10萬元/噸以上(普通有機酸價格僅為0.4-1萬元/噸)，導致下游產(chǎn)品成本居高不下，妨礙了其大規(guī)模應用。二.新型有機酸發(fā)酵研究進展－丙酮酸丙酮酸的應用領域丙酮酸農(nóng)業(yè)：阿托酸、谷物保護劑等多種農(nóng)藥合成前體食品工業(yè)：

功能飲料添加劑

減肥食品酸味劑醫(yī)藥工業(yè)：原料藥藥物合成前體藥物佐劑日化工業(yè)：防腐劑抗氧化劑診斷檢測試劑：伯醇/仲醇檢定轉(zhuǎn)氨酶測定脂肪族胺顯示劑丙酮酸的生產(chǎn)方式比較化學法代謝工程改造：酶轉(zhuǎn)化法發(fā)酵法篩選得到的菌種：光滑球擬酵母釀酒酵母大腸桿菌原料成本高環(huán)境污染嚴重原料成本高來源有限最適pH值高易感染噬菌體丙酮酸耐受性差轉(zhuǎn)化率較低，副產(chǎn)物多生產(chǎn)周期較長發(fā)酵過程不穩(wěn)定最適pH值低不易染菌無噬菌體高丙酮酸耐受性發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸GlucosePyruvateGlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA-KGAcCoAPyruvateOAAPDH(B1,NA)PDC(B1)PT(B6)PC(Bio)B1：硫胺素NA：煙酸Bio：生物素B6：吡哆醛

30

60

90

120

2

4

6

8

0.01

0.02

0.03

0.04

0.1

0.2

0.3

0.4

0.01

0.02

0.03

0.04

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

0

0.05

0.1

0.15

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

0

丙酮酸

/g×L-1

0

0

0

0

150

煙酸

/mg×L-1

硫胺素

/mg×L-1

吡哆醇

/mg×L-1

生物素

/mg×L-1

核黃素

/mg×L-1

葡萄糖消耗

/g×L-1

細胞生長

/OD660

丙酮酸產(chǎn)率

/g×g-1

選育維生素缺陷型酵母光滑球擬酵母丙酮酸代謝優(yōu)化培養(yǎng)基中維生素供給XXXX菌株選育不同kLa下發(fā)酵動力學曲線不同kLa下溶氧、產(chǎn)率變化ConstantkLa

/h-1Parameters450300200r

(IG)/(g/L)118.6119.4124.8r

(RG)/(g/L)

11.9

13.2

6.4Totalfermentationtime/h

85

68

60Glucoseconsumptionrate/(g/(L?h))1.141.561.97w

(Glucoseconversion)/%

90.0

88.9

94.9r

(Pyruvate)/(g/L)

77.3

69.0

57.2Productivity/(g/(L?h))

0.91

1.01

0.95Yp/s

/(g/g)0.7240.6490.483d

(DCW)/(g/L)

13.2

14.5

15.6Averagem

ofthefirst16h/h-1

0.238

0.190

0.139Averagem

oftheprocess/h-1

0.047

0.073

0.084r

(NH4Clconsumption)/(g/L)

5.66

5.88

6.06r

(KH2PO4

consumtion)/(g/L)

1.35

1.23

1.12r

(Ethanol)/(g/L)

1.34

1.55

1.67不同供氧控制模式下發(fā)酵過程參數(shù)高溶氧下，丙酮酸產(chǎn)率較高(0.724g/g)，葡萄糖消耗速度(生產(chǎn)強度)較慢(1.14g/(Lh))低溶氧下，細胞消耗葡萄糖速度加快(1.97g/(Lh))，丙酮酸產(chǎn)率(0.483g/g)卻明顯下降不同供氧控制模式下發(fā)酵過程參數(shù)丙酮酸產(chǎn)率細胞產(chǎn)率發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸代謝網(wǎng)絡分析DO=10%DO=85%高溶氧下轉(zhuǎn)化率高的原因:DO從85%到10%，PEP到Pyr的通量增加了20%，丙酮酸代謝的通量下降了63.3%輔因子分析低溶氧下生產(chǎn)強度提高原因：DO從85%到10%，總ATP、NADH下降31.4%、18.6%，糖耗速度上升59%總ATP下降31.4%,NADH下降18.6%生產(chǎn)強度(糖耗速度)DO=10%DO=85%采用單一供氧模式(高或低)，不能同時達到高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強度發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸實現(xiàn)相對統(tǒng)一高產(chǎn)量(69.4g/L)高產(chǎn)率(0.636g/g)高生產(chǎn)強度(1.95g/(Lh))

分階段供氧模式發(fā)酵0-16h控制kLa為450h-1發(fā)酵16h后將kLa降低至200h-1發(fā)酵過程碳平衡分析前16h較高溶氧有利于碳流合成細胞；16h后耗氧速率恒定，碳流轉(zhuǎn)向合成丙酮酸必須進行分階段溶氧控制！如何分階段？發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸美國科學院院士LO.Ingram在PNAS上的論文11次引用本團隊丙酮酸高效合成的論文，并比較表明本團隊獲得了國際最高發(fā)酵水平。

2篇有關丙酮酸發(fā)酵微生物生理特性和優(yōu)化技術的博士論文2009、2011年分別獲發(fā)酵工程領域至今唯一的兩篇全國優(yōu)秀博士論文被世界上最大發(fā)酵公司之一日本味之素公司購買，為該公司從中國購買的唯一技術發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸二.新型有機酸發(fā)酵研究進展－丙酸丙酸的應用及市場2012:260mlbs(117,936tonnes)化學法：2萬/噸發(fā)酵法：6萬/噸（食品安全）丙酸鈣價格06年全球產(chǎn)量37.7萬噸75%用于谷物和飼料防腐消費者熱衷于使用天然、綠色、健康的發(fā)酵級丙酸鈣作為食品防腐劑化學合成法微生物發(fā)酵法烴氧化法、乙烯羰基化法食品安全問題原料廉價、可再生過程綠色、環(huán)保環(huán)境污染嚴重資源不可再生微生物發(fā)酵法——低碳、環(huán)保、綠色、安全!丙酸的生產(chǎn)方法丙酸桿菌代謝工程改造策略過量表達甘油脫氫酶（gldA），提高對甘油的利用速率過量表達蘋果酸脫氫酶（mdh），富馬酸水合酶（fumC），提高丙酸代謝途徑通量gldAmdhfumC丙酸發(fā)酵的問題丙酸桿菌對碳源利用率低，生長慢；代謝途徑過程中存在若干限速酶，大大抑制了丙酸的積累篩選丙酸高產(chǎn)菌從奶制品廠取樣低丙酸濃度富集高丙酸濃度初篩產(chǎn)量檢測復篩242529303236菌種鑒定篩選野生型質(zhì)粒細胞壁裂解條件優(yōu)化

Blank12345678Lysozyme00.500.50.51110ProteinaseK000.50.510.5101Result---++++--條件:溶菌酶20mg/mL37oC,蛋白酶K2mg/mL56oC.“-”表示細胞壁沒有裂解.“+”表示細胞壁被裂解.菌種是否含有質(zhì)粒P.a×25×32√29×30×24×36×質(zhì)粒電泳圖質(zhì)粒鑒定分析質(zhì)粒ORF轉(zhuǎn)錄水平分析丙酸高產(chǎn)菌、野生質(zhì)粒的篩選以及質(zhì)粒分析過量表達甘油脫氫酶電轉(zhuǎn)化241000菌落PCR菌種鑒定Marker100012Marker151110001235371000Marker100012野生菌與工程菌分批發(fā)酵對比△:丙酸(PA),□:甘油濃度,▲:細胞干重(DCW),■:乙酸(AA),◆:琥珀酸(SA),?:甘油脫氫酶比酶活.2929(pZGX03-gldA)菌株PA(g/L)YP/S(g/g)YP/A(g/g)rPA/Glycerol(g/g)生產(chǎn)強度(gL-1h-1)2922.0614.618.20.730.1529(pZGX03-gldA)28.23239.080.9410.20過量表達甘油脫氫酶工程菌的丙酸產(chǎn)量比野生菌提高了28%過量表達丙酸代謝限速酶GenomeofKlebsiellapneumoniaeBluntingligationBluntingligationmdhfumCP.jenseniiATCC4868(pZGX04-fumC)和P.jenseniiATCC4868(pZGX04-mdh)分批補料發(fā)酵□,glycerol;△,PA;▲,LA;■,DCW;◆,AA.富馬酸水合酶基因和蘋果酸脫氫酶基因表達載體的構建過量表達丙酸代謝限速酶菌株周期(h)DCW(g/L)副產(chǎn)物(g/L)生產(chǎn)強度(g?L-1?h-1)提高(%)丙酸乳酸乙酸P.jenseniiATCC48682283.6526.952.722.410.118-P.jenseniiATCC4868(pZGX04-gldA)2283.4134.622.862.600.15228.46P.jenseniiATCC4868(pZGX04-fumC)2283.3434.522.832.570.15628.09P.jenseniiATCC4868(pZGX04-mdh)2283.3536.092.702.510.16433.91不同菌株丙酸發(fā)酵參數(shù)對比過量表達甘油脫氫酶基因的工程菌丙酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了28.46%過量表達富馬酸水合酶基因的工程菌丙酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了28.09%過量表達蘋果酸脫氫酶基因的工程菌丙酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了33.91%共表達關鍵限速酶mdh-fumCElectrotransformation富馬酸水合酶基因和蘋果酸脫氫酶基因共表達載體的構建示意圖三株共表達載體pZGX04-gldA-mdh,pZGX04-gldA-fumC,pZGX04-mdh-fumC的物理圖譜共表達關鍵限速酶不同菌株丙酸分批發(fā)酵參數(shù)對比共表達蘋果酸脫氫酶和富馬酸水合酶基因的工程菌丙酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了36.73%共表達甘油脫氫酶和富馬酸水合酶基因的工程菌丙酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了39.22%共表達甘油脫氫酶和蘋果酸脫氫酶基因的工程菌丙酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了46.31%菌株周期(h)DCW(g/L)副產(chǎn)物(g/L)生產(chǎn)強度(g?L-1?h-1)提高(%)丙酸乳酸乙酸P.jenseniiATCC48682283.6526.952.722.410.118-P.jenseniiATCC4868(pZGX04-mdh-fumC)2283.1636.852.652.330.16236.73P.jenseniiATCC4868(pZGX04-gldA-fumC)2283.2637.522.852.510.16539.22P.jenseniiATCC4868(pZGX04-gldA-mdh)2283.2839.432.742.550.17346.31氧化還原電位（ORP）發(fā)酵優(yōu)化不控制ORP分批發(fā)酵□,甘油;△,丙酸;○,pH;▲,乳酸;■,DCW;◆,乙酸;

，ORP.不控制ORP發(fā)酵，ORP下降迅速，后期產(chǎn)酸能力低氧化還原電位（ORP）發(fā)酵優(yōu)化不同ORP對分批發(fā)酵的影響□,甘油;△,丙酸;○,pH;▲,乳酸;■,DCW;◆,乙酸高ORP條件下，菌體濃度高；低ORP條件下，單位菌體產(chǎn)酸能力高氧化還原電位（ORP）發(fā)酵優(yōu)化三階段ORP控制對分批發(fā)酵的影響□,甘油;△,丙酸;○,pH;▲,乳酸;■,DCW;◆,乙酸提出三階段ORP控制策略：0-36h，控制ORP為-200mV；36-156h，控制ORP為350mV，156h后控制ORP為-400mV。三階段ORP控制分批發(fā)酵丙酸產(chǎn)量比不控制ORP發(fā)酵提高了27.7%10m3發(fā)酵罐放大試驗丙酸10m3罐中試發(fā)酵過程曲線—□—residualglycerol,—△—PA,—■—DCW,—▲—SA,—*—AA丙酸最高產(chǎn)量為47.28g/L，生產(chǎn)強度為0.197g·L-1h-1全球第二家采用發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸二.新型有機酸發(fā)酵研究進展－α-酮戊二酸

-酮戊二酸的應用降低病患機體損耗清除自由基，延緩衰老提高繁殖率，促進骨骼的生長有機中間體體格增強劑、運動飲料添加劑醫(yī)藥化妝品食品化工飼料

-酮戊二酸市場概況國際市場食品級-酮戊二酸潛在市場容量約為1萬噸

名稱價格(RMB/Kg)純度用途-酮戊二酸28098%醫(yī)藥、化工中間體L-精氨酸：-酮戊二酸鈉鹽(2:1)35099%運動飲料添加劑L-鳥氨酸：-酮戊二酸鈉鹽(1:1)65099%運動飲料添加劑化學法發(fā)酵法篩選得到的菌種：解脂亞諾酵母

-酮戊二酸的生產(chǎn)方法生產(chǎn)效率低、環(huán)境非友好和有毒試劑使用，限制其在醫(yī)藥、保健品和食品等高附加值產(chǎn)品生產(chǎn)應用生產(chǎn)效率高環(huán)境友好食品安全性高食品安全級生物法生產(chǎn)-酮戊二酸土壤樣品維生素B1缺陷型篩選500株微生物菌株0.1g/L13.4%0.1-1g/L74.4%1-10g/L6.4%10g/L5.8%菌落形態(tài)AGTCTAGTATAAACAATTATACAGTGAAACTGCGAACGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTTTCTACATGGATAACCGTGATAACTTCAGAACTAATACATGACAGCCTTCTGGCGTATATATTAGATACAAACCAACAGTATGGTGATTCATAATATCTTGTCGAACCGATCTTCGGTGTATCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTGTCGATGGTAGGATCGTGGCCTACCATGGTAACAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCTATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATATATAACGATCCGGGGCTCTTTGAGTTTCGGAATTGGAATGAGTACAATTTAAACACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTG18SrRNAYarrowialipolyticaWSH-Z06生物法生產(chǎn)-酮戊二酸的關鍵問題當以甘油為唯一碳源時，發(fā)酵6天后-KG產(chǎn)量可達30g/L左右，但是發(fā)酵液中同時會積累大量的副產(chǎn)物—丙酮酸(30g/L左右)。Y.lipolyticaWSH-Z06搖瓶發(fā)酵曲線-KG(■),Glycerol(●),Pyruvate(▲),DCW(▼)

存在的問題1.輔因子調(diào)控3.節(jié)流2.開源4.調(diào)控轉(zhuǎn)運蛋白解決方案——代謝工程改造解脂亞洛酵母代謝工程改造解脂亞洛酵母1.輔因子調(diào)控調(diào)控乙酰輔酶A代謝促進-酮戊二酸的積累CONACS1/ACLCONACS1ACL過量表達ACS1基因使胞內(nèi)ACS比酶活達到0.92U/mgprotein，過量表達ACL基因使胞內(nèi)ACL酶活達到了1.51U/mgprotein，比對照分別提高了10.5和11.6倍，胞內(nèi)乙酰輔酶A含量分別是對照的231.2%和244.2%。調(diào)控乙酰輔酶A代謝促進-酮戊二酸的積累過量表達ACS1和ACL基因?qū)w生長和-酮戊二酸合成的影響■:-KG;●:Glycerol;▲:pyruvate;▼:DCW(A):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-CON;(B):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ACS1;(C):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ACL.提高16.2%提高28.6%Y.lipolytica-ACS1和Y.lipolytica-ACL中-酮戊二酸的產(chǎn)量分別為42.2g/L和46.7g/L，比對照菌(36.3g/L)分別提高了16.2%和28.6%。丙酮酸產(chǎn)量分別為14.5g/L和10.6g/L，比對照菌(21.2g/L)分別降低了31.6%和50%。代謝工程改造解脂亞洛酵母2.開源強化丙酮酸羧化途徑促進-酮戊二酸的積累6.5倍10.2倍CONScPYC1RoPYC2表達載體p0(hph)-ScPYC1和p0(hph)-RoPYC2的構建Y.lipolytica及其突變株胞內(nèi)PC酶活轉(zhuǎn)化子提取基因組進行PCR驗證強化丙酮酸羧化途徑促進-酮戊二酸的積累過量表達ScPYC1和RoPYC2基因?qū)w生長和-酮戊二酸合成的影響■:-KG;●:Glycerol;▲:Pyruvate;▼:DCW(A):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-CON;(B):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ScPYC1;(C):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-RoPYC2.Y.lipolytica-ScPYC1和Y.lipolytica-RoPYC2中-酮戊二酸的產(chǎn)量分別為45.2g/L和49.1g/L，比對照菌(36.3g/L)分別提高了24.5%和35.3%。丙酮酸產(chǎn)量分別為10.2g/L和6.4g/L，比對照菌(21.2g/L)分別降低了51.9%和69.8%。提高24.5%提高35.3%5M3中試結