第九章-分光光度法

第九章分光光度法《分析化學(xué)》第九章分光光度法什么是分光光度法？

基于物質(zhì)分子對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法。包括比色法、可見分光光度法、紫外分光光度法。使用中用到分光光度計(jì)，因此是一種儀器分析方法化學(xué)分析：常量組分(>1%),Er0.1%～0.2%

依據(jù)化學(xué)反應(yīng),使用玻璃儀器

化學(xué)分析法與儀器分析方法有什么不同？儀器分析：微量組分(<1%),Er1%～5%

依據(jù)物理或物理化學(xué)性質(zhì),需要特殊的儀器例:含F(xiàn)e約0.05%的樣品,稱0.2g,則m(Fe)≈0.1mg重量法

m(Fe2O3)≈0.14mg,稱不準(zhǔn)容量法

V(K2Cr2O7)≈0.02mL,測不準(zhǔn)光度法結(jié)果0.048%～0.052%,滿足要求準(zhǔn)確度高靈敏度高《分析化學(xué)》第九章分光光度法1.光的基本性質(zhì)電磁波的波粒二象性

c－真空中光速2.99792458×108m/s ~3.0×108m/sλ－波長，單位：m,cm,mm,m,nm,?

1m=10-6m,1nm=10-9m,1?=10-10mν－頻率，單位：赫茲（周）Hz次/秒

n－折射率，真空中為1光的傳播速度:波動性《分析化學(xué)》第九章分光光度法微粒性

h－普朗克(Planck)常數(shù)6.626×10-34J·s

－頻率

E－光量子具有的能量單位：J(焦耳)，eV(電子伏特)光量子，具有能量。《分析化學(xué)》第九章分光光度法波粒二象性結(jié)論:一定波長的光具有一定的能量，波長越長(頻率越低)，光量子的能量越低。單色光：具有相同能量(相同波長)的光?；旌瞎猓壕哂胁煌芰?不同波長)的光復(fù)合在一起。真空中:《分析化學(xué)》第九章分光光度法當(dāng)白光通過某一有色溶液時(shí)，該溶液會選擇性地吸收某些波長(wavelength)的光而讓未被吸收的光透射過，即溶液呈現(xiàn)透射光的顏色，亦即呈現(xiàn)的是它吸收光的互補(bǔ)光的顏色。9.1.1物質(zhì)對光的選擇性吸收《分析化學(xué)》第九章分光光度法§9.1吸光光度法基本原理光的互補(bǔ)：藍(lán)黃/nm顏色互補(bǔ)光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃480-490綠藍(lán)橙490-500藍(lán)綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍(lán)610-650橙綠藍(lán)650-760紅藍(lán)綠不同顏色的可見光波長及其互補(bǔ)光《分析化學(xué)》第九章分光光度法M+熱M+熒光或磷光M+

h

M

*基態(tài)激發(fā)態(tài)E1

（△E）E2

E=E2-

E1=h

能級結(jié)構(gòu)的量子化:物質(zhì)只能吸收某些特定波長的光;

分子或原子間能級結(jié)構(gòu)個(gè)性化:不同物質(zhì)吸收不同波長的光《分析化學(xué)》第九章分光光度法當(dāng)一束光照射到物質(zhì)或其溶液上時(shí):M可以是分子,原子,或離子電子能級的越遷電子能級間躍遷的同時(shí)總伴隨有振動和轉(zhuǎn)動能級間的躍遷?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法注意體會:紫外可見吸收光譜,紅外光譜,原子吸收等吸收光譜的來源吸收光譜or吸收曲線分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其對不同波長光的吸收程度不同，用不同波長的單色光照射，測吸光度A，畫圖。Aλ《分析化學(xué)》第九章分光光度法吸收曲線與最大吸收波長在最大吸收波長處測定吸光度，則靈敏度最高。不同物質(zhì)吸收光譜的形狀以及max不同——定性分析的基礎(chǔ)。同一物質(zhì)，濃度不同時(shí)，吸收光譜的形狀相同，Amax

不同——定量分析的基礎(chǔ)?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法400500600700/nm300525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350440nmCr2O72-、MnO4-的吸收光譜

(AbsorptionspectraofCr2O72-、MnO4-)《分析化學(xué)》第九章分光光度法9.1.2光的吸收基本定律

─朗伯-比耳（Lambert-Beer）定律A=lg(I0/It)=εbc朗伯定律(1760)A=lg(I0/It)=k1b比爾定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c吸光度介質(zhì)厚度(cm)《分析化學(xué)》第九章分光光度法注意量綱式中A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L-１；

ε

：摩爾吸收系數(shù)，單位L·mol-１·cm-１；或:A=lg(I0/It)=abc

c：溶液的濃度，單位g·L-１

a：吸收系數(shù)，單位L·g-１·cm-１

a與ε的關(guān)系為：

a=ε

/M（M為摩爾質(zhì)量）

朗伯—比耳定律數(shù)學(xué)表達(dá)式《分析化學(xué)》第九章分光光度法（1）吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)；（2）與濃度無關(guān)。（3）ε與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與波長有關(guān),與溫度有關(guān)；（4）在最大吸收波長λmax處的摩爾吸收系數(shù)ε

max:

表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度:

摩爾吸收系數(shù)ε的討論《分析化學(xué)》第九章分光光度法

ε

max越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)，用光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。

ε

>105：超高靈敏；

ε

=(6～10）×104：高靈敏；

ε

=104～103：中等靈敏；

ε

<103：不靈敏。（6）可作為定性鑒定的參數(shù)。摩爾吸收系數(shù)ε的討論《分析化學(xué)》第九章分光光度法透射比T:描述入射光透過溶液的程度

T=I

/I0吸光度A與透射比T的關(guān)系:透射比T及吸光度的加和性吸光度具有加和性(即同一入射波長下,多個(gè)物質(zhì)有吸收時(shí),總吸光度為各個(gè)物質(zhì)吸光度之和)?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法9.1.3偏離郎伯-比耳定律的原因1.現(xiàn)象標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定未知溶液的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時(shí)），這種現(xiàn)象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。2.引起偏離的因素（兩大類）

（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；

（2）化學(xué)性因素。《分析化學(xué)》第九章分光光度法物理性因素：難以獲得真正的純單色光。分光光度計(jì)只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)致對朗伯—比耳定律的正或負(fù)偏離。非單色光、雜散光、非平行入射光都會引起對朗伯—比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。

《分析化學(xué)》第九章分光光度法非單色光作為入射光引起的偏離：假設(shè)由波長為λ1和λ2的兩單色光組成的入射光通過濃度為c的溶液，則：

A1＝lg（Ｉ01/Ｉt1）＝ε

1

bc

A2＝lg(Ｉ02/Ｉt2）＝ε

2bc故：式中：Ｉ01、Ｉ02分別為λ1、λ2的入射光強(qiáng)度；

Ｉt1

、Ｉt2分別為λ1、λ2的透射光強(qiáng)度；

ε

1、ε

2分別為λ1、λ2的摩爾吸收系數(shù)；《分析化學(xué)》第九章分光光度法

A總=lg（Ｉ0總/Ｉt總)=lg(I01

+Ｉ02)/(Ｉt1

+Ｉt2

）

=lg(I01

+Ｉo2)/(Ｉ01

10-ε

1bc

+Ｉ02

10-ε

2bc

）令：ε

1-ε

2=ε

；設(shè)：Ｉ01

=Ｉ02

A總=lg(2I01)/Ｉt1(1+10-ε

bc

）

=

A1+lg2-lg(1+10-ε

bc

)

因?qū)嶋H上只能測總吸光度A總，故《分析化學(xué)》第九章分光光度法討論：

A總=A1+lg2-lg(1＋10－ε

bc

)

(1)ε

=0；即：ε

1=ε

2=ε

則：

A總

＝lg（Ｉo/Ｉt）＝ε

bc(2)ε

≠0

若ε

<0；即ε

2>ε

1；－ε

bc>0,

lg(1＋10ε

bc)值隨c值增大而增大，則標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離直線向c軸彎曲，即負(fù)偏離；反之，則向A軸彎曲，即正偏離?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法討論：

(3)｜ε

｜很小時(shí)，即ε

1≈ε

2：

可近似認(rèn)為是單色光。在低濃度范圍內(nèi)，不發(fā)生偏離。若濃度較高，即使｜ε

｜很小，A總≠Ａ1，且隨著c值增大，

A總與A1的差異愈大，表現(xiàn)為A-c曲線上部(高濃度區(qū))彎曲愈嚴(yán)重。故朗伯-比耳定律只適用于稀溶液。(4)為克服非單色光引起的偏離，首先應(yīng)選擇比較好的單色器。此外還應(yīng)將入射波長選定在待測物質(zhì)的最大吸收波長且吸收曲線較平坦處?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法討論：

選用譜帶a的復(fù)合光進(jìn)行測量，得到右圖的工作曲線，A與c基本呈直線關(guān)系。選用譜帶b的復(fù)合光進(jìn)行測量，ε的變化較大，則A隨波長的變化較明顯，得到的工作曲線明顯偏離線性。《分析化學(xué)》第九章分光光度法(2)化學(xué)性因素朗伯—比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點(diǎn)之間不發(fā)生相互作用；僅在稀溶液(c<10-2mol·L-1)時(shí)才基本符合。當(dāng)溶液濃度c>10-2

mol·L-1時(shí)，吸光質(zhì)點(diǎn)間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對光的吸收。

故：朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。

溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡時(shí),使吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度發(fā)生變化,注意保持測定條件的一致。

例：CrO42-+2H+

=Cr2O72-+H2O《分析化學(xué)》第九章分光光度法§9.2光度計(jì)及其基本部件1.分光光度計(jì)《分析化學(xué)》第九章分光光度法9.2.1

基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示《分析化學(xué)》第九章分光光度法9.2.2分光光度計(jì)的主要部件

1.光源在整個(gè)紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法2.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任意波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ2800600500400棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時(shí)折射率不同《分析化學(xué)》第九章分光光度法光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。M1M2出射狹縫光屏透鏡平面透射光柵光柵衍射示意圖原理：利用光通過光柵時(shí)發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光.《分析化學(xué)》第九章分光光度法3.樣品池樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法4.檢測系統(tǒng)將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成電流來進(jìn)行測量。光電檢測器。要求：對測定波長范圍內(nèi)的光有快速、靈敏的響應(yīng)，產(chǎn)生的光電流應(yīng)與照射于檢測器上的光強(qiáng)度成正比。(1)光電管堿金屬光敏陰極Ni環(huán)（片）h《分析化學(xué)》第九章分光光度法(2)光電二極管陣列電容器再次充電的電量與每個(gè)二極管檢測到的光子數(shù)目成正比，而光子數(shù)又與光強(qiáng)成正比。通過測量整個(gè)波長范圍內(nèi)光強(qiáng)的變化就可得到吸收光譜。電容器充電電容器放電光照射再次充電測量周期《分析化學(xué)》第九章分光光度法§9.3顯色反應(yīng)與條件的選擇為什么要進(jìn)行顯色反應(yīng)？光度分析中，對于本身無吸收的待測組分，先要通過顯色反應(yīng)將待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物，然后測定吸光度或吸收曲線。與待測組分形成有色化合物的試劑稱為顯色劑。

Fe2++3橘紅色《分析化學(xué)》第九章分光光度法9.3.1

顯色反應(yīng)的選擇1.靈敏度高2.選擇性高3.生成物穩(wěn)定4.顯色劑在測定波長處無明顯吸收(兩種有色物最大吸收波長之差,即“對比度”，要求△>60nm)?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法9.3.2

顯色反應(yīng)條件的選擇1.顯色劑用量

吸光度A與顯色劑用量cR的關(guān)系會出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。2.反應(yīng)體系的酸度

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，分別測定不同pH值條件下顯色溶液的吸光度。選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對應(yīng)的pH范圍。3.顯色時(shí)間與溫度

實(shí)驗(yàn)確定4.溶劑《分析化學(xué)》第九章分光光度法9.3.3

顯色劑無機(jī)顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨等。有機(jī)顯色劑：種類繁多偶氮類顯色劑：性質(zhì)穩(wěn)定、顯色反應(yīng)靈敏度高、選擇性好、對比度大，應(yīng)用最廣泛。偶氮胂III、PAR等。三苯甲烷類：鉻天青S、二甲酚橙等《分析化學(xué)》第九章分光光度法9.3.4

三元配合物在光度分析中的應(yīng)用特性簡介

由一種金屬離子同時(shí)與兩種不同的配位體形成的三元配合物具有下列分析特性：1.穩(wěn)定，可提高分析測定的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性

例:Ti-EDTA-H2O2三元配合物的穩(wěn)定性，比Ti-EDTA和Ti-H2O2二元配合物的穩(wěn)定性，分別增強(qiáng)約1000倍和100倍。2.比二元配合物具有更高的靈敏度和更大的對比度

靈敏度通常可提高1~2倍，有時(shí)甚至提高5倍以上。3.比二元體系具有更高的選擇性

減少了金屬離子形成類似配合物的可能性?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法§9.4吸光度測量條件的選擇9.4.1選擇適當(dāng)?shù)娜肷洳ㄩL一般應(yīng)該選擇λmax為入射光波長如果λmax處有共存組分干擾時(shí)，則應(yīng)考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長。

例:如圖,該如何選工作波長?《分析化學(xué)》第九章分光光度法9.4.2參比溶液的選擇

為什么需要使用參比溶液？

以通過參比池的光強(qiáng)度I參比代替入射光強(qiáng)度I0的,以消除比色皿器壁對光的反射,非待測物質(zhì)對光的吸收等。相當(dāng)于在待測溶液的吸光度中減去非待測溶液引起的吸光度值

選擇參比溶液所遵循的一般原則：誰干擾以誰為參比⑴若僅待測組分與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)物在測定波長處有吸收，其他所加試劑均無吸收，用純?nèi)軇ㄋ?作參比溶液；《分析化學(xué)》第九章分光光度法⑵若顯色劑或其他所加試劑在測定波長處略有吸收,而試液本身無吸收，用“試劑空白”(不加試樣溶液)作參比溶液；⑶若待測試液在測定波長處有吸收，而顯色劑等無吸收，則可用“試樣空白”(不加顯色劑)作參比溶液；⑷若顯色劑、試液中其他組分在測量波長處有吸收,則可在試液中加入適當(dāng)掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑，作為參比溶液?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法9.4.3吸光度讀數(shù)范圍的選擇不同的透射比讀數(shù)，產(chǎn)生的誤差大小不同：A=－lgT=ε

bc(1)微分：(2)(2)式除以(1)式得：Δc/c不僅與儀器的透射比讀數(shù)誤差ΔT有關(guān)，而且與其透射比讀數(shù)T的值也有關(guān)。是否存在最佳讀數(shù)范圍？何值時(shí)誤差最小？《分析化學(xué)》第九章分光光度法最佳讀數(shù)范圍與最佳值:當(dāng)：ΔT=0.5%，Δc/c~T關(guān)系曲線最佳讀數(shù)范圍:T在70%～10%,A在0.1~1.0之間時(shí),濃度相對誤差約小于2%濃度相對誤差最小時(shí)的透射比Tmin為：

Tmin＝36.8%,Amin＝0.434如何保證使吸光度讀數(shù)處在適宜范圍:

通過改變吸收池厚度待測液濃度《分析化學(xué)》第九章分光光度法§9.5吸光光度法的應(yīng)用9.5.1普通分光光度法1.單組分的測定

A-c

標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定。2.多組分的同時(shí)測定

⑴各組分的吸收曲線不重疊

⑵各組分的吸收曲線互有重疊根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。

Aλ1=ε

aλ1bca＋ε

bλ1bcb

Aλ2=ε

aλ2bca＋ε

bλ2bcb

《分析化學(xué)》第九章分光光度法9.5.2高含量組分的測定──示差法設(shè)：待測溶液濃度為cx，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為cs(cs<cx)。則：

Ax=ε

b

cx

As=ε

bcs

Ar=ΔＡ=Ａx－Ａs=ε

b(cx－cs）=ε

bΔc繪制Ar~Δc工作曲線，再根據(jù)cx=cs+Δc計(jì)算試樣濃度。實(shí)際中,是以標(biāo)準(zhǔn)溶液cs為參比,則測得的Ax實(shí)際為ΔＡ《分析化學(xué)》第九章分光光度法示差法為什么能較準(zhǔn)確地測定高濃度組分呢？普通光度法:

cs:Ts=10%，cx:Tx=5%，示差法:

cs:Ts=100%，cx:Tr=50%，

透射比讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)大了十倍。讀數(shù)落入適宜讀數(shù)范圍內(nèi)，提高了測量的準(zhǔn)確度?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法9.5.3光度滴定

光度測量用來確定滴定終點(diǎn)。靈敏，并可克服目視滴定法中的干擾。終點(diǎn)由直線外推法得到，可用于平衡常數(shù)較小的滴定反應(yīng)?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法9.5.4酸堿離解常數(shù)的測定用于測定對光有吸收的弱酸（堿）的離解常數(shù)。

HL=H++L-

(1)配制一系列總濃度(c)相等，而pH不同的HL溶液(2)測定各溶液的pH值。(3)在酸式(HL)或堿式(L-)最大吸收波長處，測吸光度?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法根據(jù)分布系數(shù)的概念(4)假設(shè)高酸度時(shí)，弱酸全部以酸式形式存在，則:

AHL=ε

HLc(5)在低酸度時(shí)，弱酸全部以堿式形式存在，則:

AL=ε

Lc《分析化學(xué)》第九章分光光度法光度法測定一元弱酸離解常數(shù)的基本公式?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法實(shí)驗(yàn)過程:每改變一個(gè)pH,測定一個(gè)吸光度A;思考:AL和AHL如何得到?9.5.5配合物組成及穩(wěn)定常數(shù)的測定摩爾比法

M+nL=MLn(1)測定金屬離子濃度cM固定，而配位體濃度cL逐漸改變的不同溶液的吸光度。作圖(2)當(dāng)cL/cM＜n時(shí)，配位不完全當(dāng)cL/cM＞n時(shí)，配位完全《分析化學(xué)》第九章分光光度法思考:吸光光度法測定配合物組成的條件是什么?9.5.6雙波長分光光度法兩束光交替照射：試液本身作參比液。主要應(yīng)用：(1)多組分混合物的測定(2)混濁樣品的測定(3)反應(yīng)動力學(xué)過程研究《分析化學(xué)》第九章分光光度法§9.6紫外吸收光譜法簡介9.6.1有機(jī)化合物電子躍遷的類型

有機(jī)化合物三種價(jià)電子：σ、π、n電子。分子軌道理論：一個(gè)成鍵軌道→反鍵軌道。外層電子均處于分子軌道的基態(tài)(成鍵或非鍵軌道)。外層電子吸收紫外或可見輻射后，從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。四種躍遷:

n→π＊<π→π＊<n→σ＊<σ→σ＊《分析化學(xué)》第九章分光光度法1.σ→σ＊躍遷

所需能量最大。飽和烷烴的分子吸收光譜出現(xiàn)在遠(yuǎn)紫外區(qū)(λmax<200nm，只能被真空紫外分光光度計(jì)檢測到)。甲烷的λmax為125nm,乙烷λmax為135nm。2.n→σ＊躍遷所需能量較大。吸收波長為150～250nm，遠(yuǎn)紫外區(qū)。含非鍵電子的飽和烴衍生物(含N、O、S和鹵素等雜原子)均呈現(xiàn)n→σ*躍遷。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n→σ*躍遷的λmax分別為173nm、183nm和227nm?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法3.

π→π＊躍遷所需能量較小，近紫外區(qū)，ε

max>104L·mol-1·cm-1以上，強(qiáng)吸收。不飽和烴、共軛烯烴和芳類均可發(fā)生該類躍遷。乙烯π→π*躍遷的λmax為162nm，ε

max為:1×104L·mol-1·cm-1共軛烯炔中的躍遷的吸收峰稱K吸收帶。苯環(huán)上的躍遷產(chǎn)生三個(gè)譜帶：E1帶（λmax~180nm，ε

max＞104），E2帶（λmax~200nm，ε

max~104）和B帶（λmax~278nm，ε

max=10~103）。用于芳香化合物的鑒別?！斗治龌瘜W(xué)》第九章分光光度法4.n→π＊躍遷需能量最低，吸收波長λmax>200nm。屬禁阻躍遷。摩爾吸收系數(shù)：10～100L·mol-1·