《水體中微囊藻基因的測定 實時熒光定量PCR法》編制說明

《水體中微囊藻基因的測定實時熒光定量PCR法》（征求意見稿）編制說明二零二三年一月

目錄1項目背景 《水體中微囊藻基因的測定實時熒光定量PCR法》編制說明1項目背景近年，水體富營養(yǎng)化已成為一個全球關注的環(huán)境問題，在富營養(yǎng)化水體中存在高濃度的營養(yǎng)性物質，如氮、磷等，可促使藻類大量生長形成水華。早在19世紀末，就有動物飲用含有藍藻污染物的水而出現(xiàn)死亡的相關報道。因此，湖泊富營養(yǎng)化和藍藻水華是同前全世界共同面臨的重大環(huán)境問題之一。在水華期間，會使湖泊生物多樣性下降，而且產毒藍藻會釋放大量生物毒素，其中藍藻產生的次級代謝產物—微囊藻毒素（Microcystin,MC）危害程度較強，它是一種在藍藻水華污染中產生量最大、出現(xiàn)頻率最高和造成危害最嚴重的藻毒素種類之一。這些毒素可在魚、蝦、蟹等水生動物富集，經食物鏈可影響人類健康，既能影響漁業(yè)養(yǎng)殖，也可造成飲用水安全等問題。產生微囊藻毒素的藻類主要有藍藻門微囊藻屬、魚腥藻屬、顫藻屬，藍藻毒素通過其危害方式可分為肝毒素和神經毒素，它們是肝癌的強烈促癌劑，另一類毒素對皮膚有刺激作用。當藍藻細胞破裂或死亡時，毒素就會被釋放到水中，常規(guī)的水處理工藝不能有效的將它去除。許多水體爆發(fā)的“水華”是由藍藻的瘋狂生長引起的，而在水華藍藻中又以微囊藻為優(yōu)勢種，常見的微囊藻中既有產毒株也有不產毒株，常規(guī)的藍藻監(jiān)測以顯微鏡下形態(tài)觀察、計數為主，方法粗略，易漏檢或誤檢。并且產毒株和不產毒株在顯微鏡下的形態(tài)是一樣的，肉眼無法分辨，因此常規(guī)顯微鏡鏡檢法準確度不高，有待于發(fā)展既快又準確的產毒微囊藻的檢測方法。2項目來源由嘉興同濟環(huán)境研究院2022年1月向浙江省質量合格評定協(xié)會提出立項申請，經省質量合格評定協(xié)會論證通過。2022浙江省質量合格評定協(xié)會團體會員轉入浙江省質量協(xié)會，標準由浙江省質量協(xié)會標準化委員會歸口。3標準制定工作概況3.1標準制定相關單位及人員3.1.1本標準牽頭組織制定單位：浙江省質量協(xié)會。3.1.2本標準主要起草單位：嘉興同濟環(huán)境研究院。3.1.3本標準參與起草單位：川源（中國）機械有限公司、南京山普羅特有限公司3.1.4本標準實驗比對單位：嘉興同濟環(huán)境研究院、寧波職業(yè)技術學院、寧波海關技術中心、南京山普羅特有限公司、云南方源科技有限公司3.1.5本標準起草人為：*3.2主要工作過程3.2.1前期準備工作。（1）2020年6月至今，嘉興同濟環(huán)境研究院同川源（中國）機械有限公司合作開展藻類快速檢測技術的開發(fā)研究。（2）2020年至2022年完成嘉興市市本級水源地藻毒素的采樣與檢測12批次，完善檢測方法。標準立項組建了標準工作組，確了負責人和各編寫人員和分工職責，如表3-1所示。表3-1人員情況序號姓名工作單位職稱分工1史少禮浙江省質量協(xié)會主任會議組織2程坡浙江省質量協(xié)會職員會議組織3郭俊明寧波大學主任/教授立項評審專家組長4吳國祥嘉興市方圓檢測技術有限公司正高立項評審專家5連加俤中國計量大學副教授立項評審專家6夏志勇浙江舜虞達環(huán)境科技集團有限公司高級工程師立項評審專家7呂升浙江省嘉興生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心正高工立項評審專家8周仰原嘉興同濟環(huán)境研究院常務副院長標準總負責9孟祥周嘉興同濟環(huán)境研究院副院長/教授標準技術負責10靳立民嘉興同濟環(huán)境研究院主任/高工標準編寫11王乾川源（中國）機械有限公司總經理標準技術對接12張秋曉川源（中國）機械有限公司職員實驗13章夏蕓川源（中國）機械有限公司職員實驗14鄭博之川源（中國）機械有限公司董事長特別助理標準技術落實15章躍龍寧波海關技術中心職員實驗數據比對16章勝喬寧波海關技術中心職員實驗數據比對17張鈞旸南京山普羅特有限公司博士實驗數據比對18魯闖寧波職業(yè)技術學院副研究員實驗數據比對19黃偉初昆明金澤實業(yè)有限公司正高級工程師實驗數據比對20余秋宏云南方源科技有限公司總經理助理/工程師實驗數據比對21雷鋒良云南方源科技有限公司主任/工程師實驗數據比對3.2.2標準草案研制必要性微囊藻毒素的檢測分析方法主要有生物分析法（如小鼠腹腔注射）、物理化學分析法（如高效液相色譜法HPLC）和生物化學分析法（如酶聯(lián)免疫檢測技術ELISA，蛋白磷酸酶抑制分析PPIA等）。上述方法均不能在毒素從藻細胞內釋放出來之前對水體中微囊藻的產毒能力進行判斷，因此無法對潛在的產毒微囊藻進行預檢以預防產毒微囊藻對人體健康及環(huán)境的危害。可行性使用實時熒光定量PCR法可以在水華爆發(fā)之前對水體中產毒微囊藻進行檢測，為水體富營養(yǎng)化的預防預警提供了可靠的數據和方法，而且其操作更簡單、快速，有效監(jiān)測預警水體安全和健康。方法檢測不會對環(huán)境造成二次污染，與傳統(tǒng)的檢測產毒微囊藻的方法相比具有明顯的優(yōu)勢。但由于沒有關于微囊藻與產毒微囊藻qPCR測定方法的國家標準/行業(yè)標準，使微囊藻與產毒微囊藻qPCR的測試沒有統(tǒng)一、規(guī)范的方法，本標準的制定可以規(guī)范、統(tǒng)一產毒微囊藻qPCR的試驗方法，為水體環(huán)境的安全和健康發(fā)展提供支撐。編制草案情況本標準編制基于前期的工作內容與數據，在實驗中固定了分析方法，形成了內部的規(guī)范操作。再經過1年的實踐驗證方法的穩(wěn)定性和可行性，形成編制草案。實驗室比對找到了4家實驗室寧波職業(yè)技術學院、寧波海關技術中心、南京山普羅特有限公司、云南方源科技有限公司，嘉興同濟環(huán)境研究院有2臺qPCR設備，分別由不同人員進行操作，做為2個數據比對實驗室，符合《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制訂技術導則》（HJ168-2020）中的要求。3.2.3征求意見2023年*月*日標準開始在面向公眾發(fā)布征求意見稿，。3.2.4專家評審2022年12月7日，省質量協(xié)會組織專家召開了《水體中微囊藻基因測定實時熒光定量PCR法》團體標準啟動評審會，評審委員會由浙江省質量協(xié)會、嘉興市方圓檢測技術有限公司、浙江省嘉興生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、浙江舜虞達環(huán)境科技集團有限公司、中國計量大學、寧波大學的7名專家組成。評審委員會審查了送審材料和標準的全部內容，并形成了評審意見。3.2.5標準報批202*年*月*日，標準形成送審稿提交省質量協(xié)會。4標準編制原則、主要內容及確定依據4.1編制原則（1）科學性原則。規(guī)范應在統(tǒng)一的技術標準下制定，并按照公開、公正、科學的評判原則開展充分論證和同行評估。（2）先進性原則。規(guī)范應充分借鑒國內外已有技術標準和最新政策文件，確保技術先進、原理正確、內容可靠。（3）實用性原則。規(guī)范應充分考慮我國現(xiàn)階段環(huán)境管理需求并與之相適應，具有較好的可操作性。4.2主要內容及確定依據4.2.1技術框架本文件按《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制訂技術導則》（HJ168-2020）中的要求和參照《轉基因植物及其產品成分檢測實時熒光定量PCR方法制定指南》（農業(yè)部2259號公告-5-2015）中的要求編寫。4.2.2內容結構本文件共9章。第1章為適用范圍，第2章為規(guī)范性引用文件，第3章為術語和定義，第4章為方法原理，第5章為試劑和材料，第6章為儀器與設備，第7章為樣品，第8章為分析步驟，第9章為質量保證與控制。4.2.3適用范圍的內容及論據本文件規(guī)定了實時熒光定量PCR法測定水體中總微囊藻基因和產毒微囊藻基因的條件與詳細步驟。本文件適用于飲用水、地表水中總微囊藻基因和產毒微囊藻基因的測定。4.2.4規(guī)范性引用文件的內容及論據本文件的規(guī)范性引用文件包括：GB/T14581水質湖泊和水庫采樣技術指導HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術規(guī)范HJ494水質采樣技術指導本文件涉及的規(guī)范性引用文件主要用于水樣的采集。4.2.5術語和定義的內容及論據Ct值cyclethreshold每個管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環(huán)數。4.2.6方法原理實時熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。本方法運用TaqMan探針法，利用熒光共振能量轉移現(xiàn)象，使系統(tǒng)中的熒光強度或者熒光種類發(fā)生變化，通過檢測這種變化可測出PCR反應體系中產物的種類和量。4.2.7試劑和材料樣品分析過程所需的試劑和材料，并按qPCR方法的要求，加入了引物和探針的序列。4.2.8儀器與設備在測定過程中所需的儀器和設備，并提出參數上的要求。4.2.9樣品（1）水樣的采集都有相關的采樣標準和規(guī)范-點位布設、采樣頻次及采樣方法按照GB/T14581、HJ/T91和HJ494的相關規(guī)定執(zhí)行。-使用采樣瓶時用水樣充分潤洗3次，再采集水樣。-使用采水器采集1L樣品至采樣瓶中。若水體透明度較高，浮游植物數量較少時，應酌情增加采樣體積。樣品采集時采樣瓶不應裝滿，以便搖勻。（2）水樣的運送和保存運輸過程應在保溫箱中保持水樣溫度1℃～5℃，應在24h內完成過濾，過濾后的樣品在-20℃冰箱中保存待檢。4.2.10分析步驟（1）準備樣品提取前的材料準備工作。（2）過濾按操作要求過濾水樣。（3）DNA提取不同廠家的提取試劑盒的操作要求可能會不一樣，需按廠家要求的步驟提取，提取成功后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.11測定測定步驟分為標準曲線的配制、反應體系配制、加樣、計算等。（1）標準曲線配制標準品源液要放在-20℃冰箱中保存，一般濃度為1011copies/μL～1012copies/μL，室溫融解。同一標準品源液反復凍融不要超過3次，否則易產生改性。移取適量標準品原液至0.5mL離心管，用無菌水稀釋至1×108copies/μL，將稀釋過標準品在震蕩器上震蕩約10秒，使用迷你離心機離心約5秒。以10倍重復稀釋步驟，逐級稀釋制作7個標準品，其系列濃度分別為：1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL。（2）反應體系配制操作前開啟生物安全柜過濾吸氣口5min～10min、UV燈開啟20min～30min。將所有的耗材與實驗工具噴上75%酒精消毒并擦拭，在生物安全柜內使用在操作前將試劑解凍并使用震蕩器混合約10s，使用迷你離心機離心約5s。反應體系在生物安全柜內配制，建議在冰盒中進行。設qPCR反應管數為n×3，n為待檢樣品數＋空白＋核驗樣品數，qPCR反應體系配制，見表2。將配好的反應體系，震蕩混合約10s，再離心約5s，轉移到qPCR試管中。qPCR反應體系試劑用量無菌DI水8.0μL酶混合液12.5μLF引子（10μmol/L）1.0μLR引子（10μmol/L）1.0μL探針（10μmol/L）0.5μL總體積23.0μL在開始操作前，將燈光關閉(探針必須要避光)（3）加樣加入2.0μL的無菌水、樣品或標準品DNA，蓋好蓋子，離心機混勻。按qPCR儀器說明書操作步驟上機檢測，并記錄結果。（4）熒光定量PCR反應參數95℃活化、180s；95℃變性、5s，退火延長60℃、20s，40個循環(huán)，每個循環(huán)結束后設置采集熒光。5，端選擇FAM熒光通道，3，端選擇無（none）熒光。不同的儀器設置會有所不同，退火延長最短時間設不到20s，從對比實驗時各單位所用型號的設備，有設備退火延長可設的最短時間為31s。（5）擴增效率計算標準系列以稀釋標準液副本數的對數為橫坐標，以Cq值為縱坐標，作線性回歸，繪制標準曲線。標準曲線應R2≥0.98，擴增效率（E）應在80％～120％。擴增效率按式（1）計算。E=（式中：b——斜率/線性系數，范圍應在-3.08～-3.59。（6）結果計算水樣中總微囊藻基因和微囊藻產毒基因的含量（C）,單位為copies/mL表示，按式（2）計算。 QUOTEC=10Cq-ab×V1式中：Ct——取得DNA數據/量化周期；a——常數項；b——斜率/線性系數；V1——提取液體積，μL；V0——過濾樣品體積，mL。4.2.12質量保證與控制空白檢驗:每10個樣品，做一個樣品空白核查，不得檢測出Ct值。校準:標準曲線相關系數≥0.995。每10個樣品應測定標線中濃度點，與標線中同濃度點Ct值差絕對值應小于1。平行樣:每個樣品至少做1個平行樣，平行測定結果Cq值最大值與最小值差應小于1。加標樣:每10個樣品，做1個樣品加標樣，接受的加標回收率范圍為80%～120%。5標準先進性體現(xiàn)通過TaqMan探針法，利用熒光共振能量轉移現(xiàn)象，使系統(tǒng)中的熒光強度或者熒光種類發(fā)生變化，通過檢測這種變化可測出PCR反應體系中產物的種類和量。其方法是一種檢測核酸片段擴增能力強、靈敏度高、通量高、可同時擴增不同基因表達不同片段的技術。具有特異性高、靈敏、快速檢測、操作簡單等特點，設計并合成已知序列的探針，再通過探針進行核酸靶序列的檢測，同時具有更低的成本和更容易控制的反應條件，能直接捕獲出目標基因。6與現(xiàn)行相關法律、法規(guī)、規(guī)章及相關標準的協(xié)調性6.1目前國內執(zhí)行的標準和文件目前國內有現(xiàn)行有效關于藻類毒素測定方法一般使用的高效液相色譜、液相色譜-質譜法或酶聯(lián)免疫吸附法，發(fā)布有國標、地標和食品、水產漁業(yè)等行標，生態(tài)環(huán)境部目前還沒有制訂藻類相關標準。如國家標準：《水中微囊藻毒素的測定》（GB/T20466-2006）、《食品安全國家標準水產品中微囊藻毒素的測定》（GB5009.273-2016）；地方標準：《水質藻類計數視野計數法》（DB37/T4163—2020）、《藻類產品中微囊藻毒素測定高效液相色譜法》DB32/T1481-2009、《水源水中微囊藻毒素測定液相色譜-串聯(lián)質譜法DB31/T1178—2019》、《生活飲用水源水中11種藻毒素的測定高效液相色譜串聯(lián)質譜法》（DB34/T3300-2018）、《淡水浮游藻類監(jiān)測技術規(guī)范》（DB32/T4005-2021）；行業(yè)標準：《水質甲萘威、臭氰菊酯、微囊藻毒素-LR的測定高效液相色譜法》（SL/T740-2016）、《出口水產品中微囊藻毒素的檢測液相色譜-質譜/質譜法》（SN/T4319-2015）、《出口水產品中微囊藻毒素的檢測液相色譜-質譜/質譜法》（SN/T4319-2015）。目前沒有微囊藻與產毒微囊藻QPCR測定方法標準的發(fā)布。國際標準ISO《Biotechnology—Requirementsforevaluatingtheperformanceofquantificationmethodsfornucleicacidtargetsequences—qPCRanddPCR》（ISO20395）中對生物目標核酸定量qPCR測定做了通用要求，沒有查到有微囊藻與產毒微囊藻qPCR測定方法標準的發(fā)布。6.2本標準與相關法律、法規(guī)、規(guī)章、強制性標準相沖突情況本規(guī)范不存在標準低于相關國標、行標和地標等推薦性標準的情況。6.3本標準引用了以下文件：（1）GB/T14581水質湖泊和水庫采樣技術指導（2）HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術規(guī)范（3）HJ494水質采樣技術指導引用文件均現(xiàn)行有效。7社會效益制定本標準可以規(guī)范、統(tǒng)一產毒微囊藻qPCR的試驗方法，為水體環(huán)境的安全和健康發(fā)展提供支撐。8重大分歧意見的處理經過和依據本文件在專家評審過程中不存在重大分歧意見，歷次專家咨詢及修改說明見附錄*和附錄*9廢止現(xiàn)行相關標準的建議無廢止現(xiàn)行標準的建議10提出標準強制實施或推薦實施的建議和理由本標準為浙江省質量協(xié)會團體標準。11貫徹標準的要求和措施建議本標準將在全國團體標準信息平臺（/）上自我聲明采用本標準，其他采用本標準的單位也應在信息平臺上進行自我聲明。本標準為檢測水中微囊藻基因的測定提供了一種實時熒光定量PCR法標準化的方式，能夠有效的規(guī)范市場和保障土壤工作的質量。建議先以團體標準的形式發(fā)布，實施一段時間后轉化為地方標準、區(qū)域性標準或行業(yè)標準。對貫徹標準的要求和措施建議如下：1、用于藻類爆發(fā)預警研究使用。2、國家或地方相關主管部門推動使用。12其他應予說明的事項本規(guī)范不涉及專利的使用?！端w中微囊藻基因的測定實時熒光定量PCR》標準研制工作組2021年XX月XX日附錄A方法驗證報告方法名稱：水體中微囊藻基因的測定實時熒光定量PCR法項目主編單位：嘉興同濟環(huán)境研究院驗證單位：同濟川源實驗室、寧波職業(yè)技術學院、寧波海關技術中心南京山普羅特有限公司、云南方源科技有限公司項目負責人及職稱：靳立民高級工程師通訊地址：浙江省嘉興市南湖區(qū)凌公塘路1994號電話告編寫人及職稱：靳立民高級工程師報告日期：2022年1月18日1原始測試數據A1.1實驗室基本情況表A1-1參加驗證的人員情況登記表姓名性別年齡職務或職稱所學專業(yè)從事相關分析工作年限實驗室及編號靳立民男43高級工程師環(huán)境監(jiān)測21同濟川源實驗室張秋曉女32／生物工程9同濟川源實驗室A蔣寶玉女26／環(huán)境工程4林安迪男27／環(huán)境安全衛(wèi)生系6B章夏蕓女30／工業(yè)分析與檢驗7魯闖男42副研究員化學工程19寧波職業(yè)技術學院微生物實驗室C邱從平男50副研究員生物化學25申芳嫡女34副研究員遺傳育種12章躍龍男30工程師8寧波海關技術中心梅山實驗室D章勝喬男48高級工程師25張鈞旸男40博士生物工程10南京山普羅特有限公司實驗室E唐婷女38高級工程師應用化學13劉玲梅女27初級工程師環(huán)境工程4余秋宏男36工程師環(huán)境科學10云南方源科技有限公司實驗室F雷鋒良男29工程師環(huán)境科學7蔡宇涵男28/微生物工程6白萍珍女29/環(huán)境工程6

表A1-2使用儀器情況登記表儀器名稱規(guī)格型號儀器出廠編號性能狀況（計量/校準狀態(tài)、量程、靈敏度等）實驗室編號實時熒光定量PCR分析儀MICPOCDx48MIC2102002/A熒光定量PCR儀Q1000+031-00268/B高速冷凍離心機HeraeusFresco2142572117（0～14800）rpmA、B實時熒光定量PCR分析儀QuantStudio3272322412/C高速冷凍離心機HeraeusFresco21S204728（0～15000）rpmC實時熒光定量PCR分析儀AB7500275006199/D實時熒光定量PCR分析儀CFXConnect788BR07065E高速冷凍離心機HeraeusFresco2140712747E全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)SLAN-96PSN220324L7/F高速冷凍離心機MultifugeX1R20180585（0~15200）rpmF表A1-3使用試劑及溶劑登記表名稱生產廠家、規(guī)格純化處理方法實驗室編號植物提取試劑盒QiagenDNeasyPlantMiniKit(50)/A、B、C、D、E、F探針和引物自制/A、B、C、D探針和引物南京山普羅特有限公司/E、FA1.2方法檢出限、測定下限測試數據表A1-4產毒微囊藻基因（mcyb）方法檢出限、測定下限測試數據表平行樣品編號產毒微囊藻基因（mcyb）（對標準溶液10copies/mL的測定）ABCDEF測定結果copies/mL138.925.180.848.631.348.7235.543.871.143.327.836.2364.425.385.844.323.733.3457.638.378.949.627.430.9548.334.072.942.430.351.4655.625.389.444.637.732.4平均值copies/mL50.532.079.845.529.738.8標準偏差Scopies/mL11.38.007.122.944.738.91t值0.982-4.2811.6-39.2-8.43-1.97方法檢出限copies/mL3826.924.09.8915.930.0測定下限copies/mL15210895.839.663.7120表A1-5總微囊藻基因（micr）方法檢出限、測定下限測試數據表平行樣品編號總微囊藻基因（micr）（對標準溶液10copies/mL的測定）ABCDEF測定結果copies/mL136.211037.849.721.626.6262.110341.444.626.222.9356.614440.545.522.934.8454.311337.846.424.826.4540.512744.344.918.633.0634.611324.6平均值copies/mL47.411839.646.422.328.0標準偏差Scopies/mL11.714.83.001.882.964.76t值-61.611.2-8.77-5.13-23.2-11.5方法檢出限copies/mL39.449.810.16.339.9616.0測定下限copies/mL15719940.425.339.864.1A1.3方法精密度測試數據表A1-6產毒微囊藻基因（mcyb）精密度測試數據平行樣品編號產毒微囊藻基因（mcyb）ABCDEF樣1（元1）樣2（元2）樣3（元4）樣2（元2）樣4（自采）樣2（元2）樣5（自采）樣2（元2）樣6（自采）樣2（元2）樣7（自采）樣2（元2）測定結果copies/mL19.01E+015.60E+067.82E+045.46E+063.68E+047.44E+062.93E+034.05E+06NA2.09E+067.89E+034.16E+0626.80E+015.00E+067.98E+045.35E+064.23E+046.54E+063.24E+034.41E+06NA2.06E+068.40E+033.99E+0637.19E+014.80E+068.26E+045.73E+063.46E+046.21E+062.69E+034.26E+06NA1.97E+068.63E+033.58E+0646.66E+014.57E+068.37E+045.17E+063.72E+047.72E+062.81E+034.57E+06NA1.94E+061.15E+043.89E+0657.66E+015.48E+067.88E+045.17E+063.45E+046.77E+063.15E+034.20E+06NA2.01E+061.10E+043.86E+0666.95E+015.22E+068.37E+045.57E+063.22E+049.12E+062.87E+034.08E+06NA2.00E+068.58E+034.28E+06平均值copies/mL7.38E+015.11E+068.11E+045.41E+063.63E+047.30E+062.95E+034.26E+06NA2.01E+069.24E+033.96E+06標準偏差Scopies/mL8.733.97E+052.50E+032.23E+053.46E+031.05E+062.08E+021.99E+05-5.56E+041.52E+032.46E+05相對標準偏差RSD（%）11.87.773.084.139.5514.47.084.68-2.7716.26.21表A1-7總微囊藻基因（micr）精密度測試數據平行樣品編號總微囊藻基因（micr）ABCDEF樣1（元1）樣2（元2）樣3（元4）樣2（元2）樣4（自采）樣2（元2）樣5（自采）樣2（元2）樣6（自采）樣2（元2）樣7（自采）樣2（元2）測定結果copies/mL11.92E+021.68E+074.02E+052.26E+079.86E+041.89E+076.83E+042.13E+079.10E+011.25E+071.82E+048.34E+0621.78E+022.05E+074.54E+052.40E+071.04E+051.45E+076.43E+041.78E+079.99E+019.59E+061.55E+048.56E+0632.56E+021.70E+074.80E+052.21E+071.02E+051.66E+076.69E+041.86E+078.13E+011.37E+071.51E+048.29E+0642.17E+021.82E+074.42E+052.39E+078.12E+041.56E+076.17E+041.65E+071.48E+028.68E+061.63E+048.13E+0652.10E+021.64E+074.67E+052.40E+079.29E+041.58E+077.02E+041.78E+071.12E+021.01E+071.50E+047.76E+0662.15E+021.74E+074.58E+052.40E+079.36E+041.89E+076.69E+041.98E+071.32E+021.11E+071.55E+048.13E+06平均值copies/mL2.11E+021.77E+074.51E+052.34E+079.54E+041.67E+076.64E+041.86E+071.11E+021.09E+071.59E+048.20E+06標準偏差Scopies/mL26.61.49E+062.46E+048.55E+058.23E+031.82E+063.00E+031.70E+0625.41.88E+061.20E+032.69E+06相對標準偏差RSD（%）12.68.445.463.658.6310.94.529.1122.917.27.543.27A1.4方法正確度測試數據表A1-8共同樣品測試數據平行號共同樣（試樣2）產毒微囊藻基因（mcyb）總微囊藻基因（micr）ABCDEFABCDEF測定結果（copies/mL）15.60E+065.46E+067.44E+064.05E+065.36E+064.16E+061.68E+072.26E+071.89E+072.13E+071.25E+078.34E+0625.00E+065.35E+066.54E+064.41E+064.04E+063.99E+062.05E+072.40E+071.45E+071.78E+079.59E+068.56E+0634.80E+065.73E+066.21E+064.26E+063.85E+063.58E+061.70E+072.21E+071.66E+071.86E+071.37E+078.29E+0644.57E+065.17E+067.72E+064.57E+063.80E+063.89E+061.82E+072.39E+071.56E+071.65E+078.68E+068.13E+0655.48E+065.17E+066.77E+064.20E+064.50E+063.86E+061.64E+072.40E+071.58E+071.78E+071.01E+077.76E+0665.22E+065.57E+069.12E+064.08E+065.04E+064.28E+061.74E+072.40E+071.89E+071.98E+071.11E+078.13E+06平均值x（copies/mL）5.11E+065.41E+067.30E+064.26E+064.43E+063.96E+061.77E+072.34E+071.67E+071.86E+071.09E+078.20E+06驗證實驗室平均值（copies/mL）5.08E+061.62E+07相對誤差RE（%）0.59%6.50%43.70%-16.14%-12.80%-22.05%9.26%44.44%3.09%14.81%-32.72%-49.38%

表A1-9產毒微囊藻基因（mcyb）實際樣品加標測試數據平行號產毒微囊藻基因（mcyb）ABCDEF樣1（元1）樣2（元2）樣3（元4）樣2（元2）樣4（自采）樣2（元2）樣5（自采）樣2（元2）樣6（自采）樣2（元2）樣7（自采）樣2（元2）濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標測定結果copies/mL19.01E+012.39E+035.60E+062.58E+077.82E+041.70E+055.46E+063.08E+073.68E+049.57E+047.44E+062.16E+072.93E+033.13E+034.05E+062.37E+07NA1.25E+025.36E+062.35E+077.89E+036.64E+044.16E+062.53E+0726.80E+012.94E+035.00E+062.28E+077.98E+041.79E+055.35E+063.23E+074.23E+041.40E+056.54E+062.61E+073.24E+033.74E+034.41E+061.86E+07NA2.16E+024.04E+061.65E+078.40E+037.16E+043.99E+061.91E+0737.19E+012.61E+034.80E+062.50E+078.26E+041.74E+055.73E+062.98E+073.46E+049.81E+046.21E+062.26E+072.69E+033.24E+034.26E+062.72E+07NA1.84E+023.85E+062.53E+078.63E+035.44E+043.58E+061.87E+0746.66E+012.00E+034.57E+062.17E+078.37E+041.75E+055.17E+063.21E+073.72E+049.03E+047.72E+062.42E+072.81E+033.61E+034.57E+062.78E+07NA1.71E+023.80E+061.98E+071.15E+044.84E+043.89E+063.03E+0757.66E+012.65E+035.48E+062.12E+077.88E+041.81E+055.17E+062.98E+073.45E+048.50E+046.77E+062.20E+073.15E+033.41E+034.20E+062.90E+07NA2.01E+024.50E+062.83E+071.10E+045.22E+043.86E+061.73E+0766.95E+012.78E+035.22E+062.18E+078.37E+041.78E+055.57E+063.27E+073.22E+041.21E+059.12E+062.83E+072.87E+033.10E+034.08E+062.04E+07NA1.91E+025.04E+062.59E+078.58E+034.97E+044.28E+061.81E+07平均值、copies/mL7.38E+012.56E+035.11E+062.31E+078.11E+041.76E+055.41E+063.15E+073.61E+041.03E+057.24E+062.40E+072.93E+033.36E+034.26E+062.41E+07NA1.79E+024.39E+062.29E+079.24E+035.65E+043.95E+062.10E+07加標量μcopies10^3/210^7/210^5/210^7/210^5/210^7/210^3/210^7/210^2/210^6/210^3/210^7/2加標回收率%）1008281114858211388828311186

表A1-10總微囊藻基因（micr）實際樣品加標測試數據平行號總微囊藻基因（micr）ABCDEF樣1（元1）樣2（元2）樣3（元4）樣2（元2）樣4（自采）樣2（元2）樣5（自采）樣2（元2）樣6（自采）樣2（元2）樣7（自采）樣2（元2）濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標濃度加標測定結果copies/mL11.92E+022.14E+031.68E+073.79E+074.02E+051.76E+062.26E+073.33E+079.86E+041.29E+051.89E+073.29E+073.32E+046.83E+042.13E+073.51E+079.10E+012.30E+021.25E+073.83E+071.82E+046.75E+048.34E+062.82E+0721.78E+022.19E+032.05E+073.64E+074.54E+051.79E+062.40E+073.93E+071.04E+051.45E+051.45E+073.90E+072.94E+046.43E+041.78E+073.91E+079.99E+012.77E+029.59E+062.57E+071.55E+044.62E+048.56E+06246E+0732.56E+022.22E+031.70E+073.62E+074.80E+052.27E+062.21E+073.27E+071.02E+051.38E+051.66E+074.07E+073.43E+046.69E+041.86E+074.03E+078.13E+011.94E+021.37E+072.89E+071.51E+045.73E+048.29E+062.32E+0742.17E+022.12E+031.82E+073.69E+074.42E+051.90E+062.39E+073.98E+078.12E+041.15E+051.56E+073.63E+072.86E+046.17E+041.65E+073.40E+071.48E+022.33E+028.68E+062.01E+071.63E+045.03E+048.13E+062.97E+0752.10E+022.43E+031.64E+073.64E+074.67E+051.65E+062.40E+073.40E+079.29E+041.47E+051.58E+073.18E+072.94E+047.02E+041.78E+073.63E+071.12E+021.89E+021.01E+073.26E+071.50E+044.53E+047.76E+062.23E+0762.15E+021.89E+031.74E+073.71E+074.58E+051.90E+062.40E+073.64E+079.36E+041.36E+051.89E+074.27E+073.50E+046.69E+041.99E+073.18E+071.32E+022.40E+021.11E+072.43E+071.55E+046.16E+048.13E+062.41E+07平均值、copies/mL2.11E+022.17E+03E+073.68E+074.51E+051.87E+062.34E+073.59E+079.50E+041.35E+051.66E+073.70E+073.16E+041.59E+041.86E+073.60E+071.86E+072.25E+021.09E+072.83E+071.59E+045.41E+048.20E+062.52E+07加標量μcopies10^3/210^7/210^6/210^7/210^5/210^7/210^3/210^7/210^2/210^6/210^3/210^7/2加標回收率%）841129996871159610782839284A2方法驗證數據匯總A2.1方法檢出限、測定下限匯總表A2-1方法檢出限測定下限數據匯總表實驗室號產毒微囊藻基因（mcyb）總微囊藻基因（micr）檢出限（copies/mL）測定下限（copies/mL）檢出限（copies/mL）測定下限（copies/mL）A3815239.4157B26.910849.8199C2495.810.140.4D9.8939.66.3325.3E15.963.79.9639.8F301201664.1結論：各驗證實驗室使用標準編制組提供的統(tǒng)一方法，按操作步驟及流程進行分析操作，最終的方法檢出限為各驗證實驗室所得數據的最高值。產毒微囊藻基因（mcyb）檢出限為38copies/mL，測定下限為152copies/mL；總微囊藻基因（micr）檢出限為50copies/mL，測定下限為200copies/mL。A2.2方法精密度數據匯總表A2-2共同樣精密度測試數據匯總表實驗室號產毒微囊藻基因（mcyb）總微囊藻基因（micr）xi（copies/mL）Si（copies/mL）RSDi（%）xi（copies/mL）Si（copies/mL）RSDi（%）A5.11E+063.97E+057.771.77E+071.49E+068.44B5.41E+062.23E+054.132.34E+078.55E+053.65C7.30E+061.05E+0614.41.67E+071.82E+0610.9D4.26E+061.99E+054.681.86E+071.70E+069.11E2.01E+065.56E+042.771.09E+071.88E+0617.2F3.96E+062.46E+056.218.20E+062.69E+063.27x（copies/mL）