常規(guī)細胞培養(yǎng)要點

常規(guī)細胞培養(yǎng)要點初步掌握基本的無菌操作要領養(yǎng)成良好的無菌操作習慣形成可持續(xù)的實驗環(huán)境促進實驗的順利進行操作準備環(huán)境消毒1將實驗所需大中小已高壓滅菌槍盒，移液器，已高壓滅菌鋁制飯盒（內(nèi)裝1.5mlEP管或15ml，50ml離心管，5ml槍頭等）放入無菌操作臺。2無菌操作臺及房間實驗前紫外消毒半小時。3操作時關閉房間紫外，通風5-10min，關閉操作臺紫外，打開風機及照明。操作準備實驗準備1換上專用實驗服和手套，并用消毒酒精消毒手套2用75%酒精擦拭放置顯微鏡的桌面及顯微鏡載物臺并打開顯微鏡3打開CO2培養(yǎng)箱取出細胞置于顯微鏡上觀察，以此決定進行何種操作。若發(fā)現(xiàn)細胞有污染，及時將其丟棄。（垃圾桶分干濕兩種，帶液體的東西棄于濕桶，請勿混棄）4用75%酒精擦拭無菌操作臺的臺面，從冰箱中取出1×PBS1×Trpysin以及合適的培養(yǎng)基，用消毒酒精擦拭其外表面后放入操作臺（培養(yǎng)基混勻確認其無渾濁）

貼壁細胞的換液與傳代換液1吸棄培養(yǎng)盤內(nèi)的液體再換入新鮮完全培養(yǎng)液。大部分細胞培養(yǎng)一般用DMEM+10%FBS,或用MEM,RPMI-1640。用其他特殊培養(yǎng)基的細胞可在ATCC網(wǎng)站查詢或詢問來源地。2盤內(nèi)排除污染的情況外，若有較多懸浮物可用1×PBS洗一遍后再加新鮮培液。3放回培養(yǎng)箱貼壁細胞的換液與傳代傳代1吸棄上清，加入1×PBS清洗剩余培液后加入1×Trpysin進行消化，期間應將其放入培養(yǎng)箱，溫度適于胰酶消化。時不時將其取出放鏡下觀察掌握消化進程（制定一個時間梯度，如：2min，5min，10min等）鏡下觀察細胞從多變體或梭狀等皺縮為圓球狀，輕敲盤邊就飄起移動即為消化完全。貼壁細胞的換液與傳代傳代2加入完全培液終止消化，終止體積至少為1:11）實驗目的僅為留種則從細胞懸液中取出一部分丟棄后再補足培液。若細胞對胰酶敏感則需要將剩下的細胞懸液移至離心管離心去上清后用培液重懸重新鋪板。2）按實驗要求分盤則需現(xiàn)對細胞進行計數(shù)。之后按計數(shù)結(jié)果計算后分入相應培養(yǎng)盤。

3）將分好后的細胞放回培養(yǎng)箱

計數(shù)方法用70%酒精清潔血紅細胞計數(shù)板和蓋玻片，鏡頭紙擦干；取20μl細胞懸浮液小心地從蓋玻片的邊緣加入血紅細胞計數(shù)板的兩個室，通過毛細管作用，細胞懸浮液在血紅細胞計數(shù)板和蓋玻片之間均勻地分布；切勿加入過量，只要充滿即可。置入顯微鏡，用10倍的目鏡和10倍的物鏡觀察細胞，統(tǒng)計其中四個大的方陣中的細胞數(shù)，如果細胞濃度太高，可稀釋再統(tǒng)計，記住稀釋的倍數(shù)；細胞濃度=（四個方陣中細胞數(shù)之和/4）X104/ml，方陣上方和左邊邊緣的細胞可統(tǒng)計在內(nèi)，但下方和右邊邊緣的細胞則不應統(tǒng)計，如有細胞團計為一個。用70%酒精和蒸餾水清潔血紅細胞計數(shù)板和蓋玻片，鏡頭紙擦干。計數(shù)方法細胞計數(shù)板的基本結(jié)構(gòu)和計數(shù)范圍

血紅細胞計數(shù)板(hemocytometer)

含有兩個室，每個室被劃分為9個方陣，其中4個方陣有16個小方格，為0.1mm3

或1x10–4

ml，細胞濃度。取決于已知體積中的細胞數(shù)細胞的凍存與復蘇凍存1準備好凍存細胞所需的低溫冰箱，液氮罐及液氮，細胞凍存管并寫好標簽：細胞名稱，時間及保存人；2取對數(shù)生長期的細胞（融合度達70-80%），收集細胞前24h換液一次3吸出培養(yǎng)液，用PBS洗細胞一次，除去，加入1mlTrypsin-EDTA,放入37℃保溫3-5min,使細胞脫離底部；4離心細胞并重懸浮于10%DMSO/90%FBS中，大約1-5x106cells/ml5每個凍存管中加入1ml細胞懸浮液，擰緊蓋子6冷凍細胞應緩慢降溫，可用裝有異丙醇的冷凍盒(每兩個小時溫度下降10℃)，放入-20℃冰箱中過夜，第二天再轉(zhuǎn)至-80℃冰箱，可保存數(shù)月，如需長期保存，應轉(zhuǎn)至液氮中。細胞的凍存與復蘇復蘇

在37℃水浴中預熱培養(yǎng)基；將凍存的細胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中至解凍，用紙巾擦干管外水分，70%酒精消毒；）檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。）操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。將細胞用移液管放入適量預熱的培養(yǎng)基中，混勻，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；由于細胞保存液中通常含有DMSO，對細胞生長有毒性，應除去。對于貼壁細胞，待其貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基；對于初始細胞，懸浮培養(yǎng)的細胞以及一些敏感細胞類型應及時通過離心除去DMSO操作注意點實驗操作應在臺面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操

作。小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。操作時所用容器若非必須不要有兩個以上開口。容器打開后，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。平移取物時不要經(jīng)過開口上方，繞過去。操作時若操作面有液體或雜物要及時清理，隨時保持清潔。若大多數(shù)容器為塑料制品時，慎用酒精燈，以免因受熱變形造成密封不佳。操作注意點培養(yǎng)容器保持清潔，培養(yǎng)容器特別是盤蓋和瓶蓋內(nèi)側(cè)建議用真空吸液泵清潔由內(nèi)而外。使用移液器和移液槍若不慎吸至槍體和移液管上方棉塞，槍頭，移液管及內(nèi)容物丟棄。實驗結(jié)束整理清潔臺面：1）調(diào)槍至最大量程；2)空槍盒，飯盒，捆綁繩帶出細胞房至裝填處；3）冰箱拿出的東西放回冰箱，空管空瓶丟入濕桶，廢液缸內(nèi)容物倒入濕桶并用酒精消毒放回；4）酒精擦拭臺面，關門，關風機，關照明，開紫外。細胞培養(yǎng)的污染及控制細菌污染培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應仔細觀察。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。污染后重要的細胞加PS，不重要的丟棄。真菌污染真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。個體細小，有增多趨勢。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。污染后丟棄。細胞培養(yǎng)的污染及控制支原體污染多吸附于細胞表面或散在于細胞之間，污染后，培液背景像罩了紗霧狀的東西看不清。部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染病毒污染本實驗室一般是293感染腺病毒細胞產(chǎn)生病