水稻淀粉合成相關(guān)基因研究

水稻淀粉合成相關(guān)基因(starchsynthesis-relatedgenes,SSRGs)研究向珣朝西南科技大學(xué)水稻品質(zhì)是指稻谷和稻米的質(zhì)量，直接關(guān)系到水稻生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益和人民的生活水平。根據(jù)優(yōu)質(zhì)稻谷國標(biāo)GB/T17891-1999，稻谷和稻米品質(zhì)包括加工品質(zhì)、外觀品質(zhì)、蒸煮食味品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)等。其中最重要的是外觀品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)；外觀品質(zhì)決定稻米的商品性，蒸煮食味品質(zhì)決定口感的好壞。5/22/20122XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology外觀品質(zhì)鑒定相對簡單；蒸煮食味品質(zhì)(eatingandcookingqualities,ECQs)包括直鏈淀粉含量(AmyloseContent,AC)、膠稠度(gelconsistency,GC)和糊化溫度(gelatinizationtemperature,GT)，ECQs是稻米品質(zhì)中最重要也是最復(fù)雜的指標(biāo)，傳統(tǒng)鑒定方法相對繁雜。優(yōu)質(zhì)稻米一般具有適中的表觀直鏈淀粉含量(ApparentAmylaseContent，AAC)，高的GC和低的GT。2/4/20233XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology

一、高等植物淀粉的生物合成協(xié)同完成的酶有：1.ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADPglucosepyrophosphorylase，AGP)；2.淀粉合成酶(starchsynthase，SS)；3.淀粉分支酶(StarchBranchingEnzyme，SBE)；4.淀粉脫支酶(StarchDebranchingEnzyme，DBE)。每一種酶有多種同工型。2/4/20234XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologyMainpathwayofstarchbiosynthesisincludingsucrosesynthesis,sucrosedegradationandstarchsynthesisinriceFBP1,fructose-1,6-bisphophatase1;PGM,phosphoglucomutase;AGPase,ADP-glucosepryophosphorylase;PPi,pyrophosphate.2/4/20235XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology淀粉合成酶(starchsynthase，SS)根據(jù)在提取液中與淀粉粒的結(jié)合程度不同，分為顆粒結(jié)合淀粉合成酶（GBSS）與可溶性淀粉合成酶（SSS）兩類，前者與淀粉粒緊密結(jié)合在一起，而后者與淀粉粒結(jié)合程度較弱。淀粉合成酶以ADPG為底物催化形成α-1,4糖苷鍵，從而線性延長葡聚糖鏈。2/4/20236XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology稻米淀粉合成相關(guān)的主要5大類酶：1.ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucosepyrophosphorylase，AGPase)2.顆粒結(jié)合淀粉合成酶(granulebindingstarchsynthase，GBSS)3.可溶性淀粉合成酶(solublestarchsynthase，SSS)4.淀粉分支酶(starchbranchingenzyme，SBE)5.脫分支酶(debranchingenzyme，DBE)各類酶又存在數(shù)目不等的同工型(isoforms)，編碼以上酶的基因有近20個(gè)之多，各個(gè)基因在淀粉合成的不同階段起著不同的作用。2/4/20237XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologySimplifiedstarchsynthesissystemincereal2/4/20238XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology2/4/20239XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology1.ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucosepyrophosphorylase，AGPase)AGP催化淀粉合成中的第一個(gè)反應(yīng)，產(chǎn)生有活性的供體ADP-葡萄糖(ADP-glucose，ADPG)。AGP有兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成，分別由兩個(gè)基因編碼。AGP有兩種存在場所：細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體。谷類作物的胚乳中，大部分(85–95%)存在于細(xì)胞質(zhì)中。2/4/202310XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology2.顆粒結(jié)合淀粉合成酶(granulebindingstarchsynthase，

GBSS)GBSS有兩種同工型：GBSSI和GBSSII。GBSSI由Waxy(Wx)基因編碼，它的主要功能是合成直鏈淀粉。GBSSII的主要功能是在果皮等非儲藏器官中合成臨時(shí)性的直鏈淀粉。Wx

基因變異是導(dǎo)致水稻直鏈淀粉含量變異最主要的原因。目前在Wx

座位上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在5種復(fù)等位基因(Wxa,Wxb,Wxop,Wxin

和wx)，分別存在于普通秈稻、粳稻、云南軟米品種、美國長粒粳稻Lemont和糯稻中。2/4/202311XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologyThestructureoftheWxgeneofriceRegionAis867bp(alignedlength)includingthe5splicejunctionofintron1andp-SINE1-r1,andregionBis3,455bp(alignedlength)includingthecodingregions,p-SINE1-r2andTnr-1.2/4/202312XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologyWxb

與Wxa

相比，第1內(nèi)含子+1位堿基由G變?yōu)門，降低了Wx基因轉(zhuǎn)錄后mRNA的剪接效率；Wxop

與Wxa

相比，在第4外顯子的A762突變?yōu)镚762，導(dǎo)致氨基酸由Asp變?yōu)镚ly；而Wxin

與Wxa

相比，則是在第6外顯子中的A1132突變?yōu)镃1132，其編碼的氨基酸由Tyr變?yōu)镾er；在Wx基因的第2外顯子中23bp的插入，導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)，是形成wx等位基因的根本原因。2/4/202313XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology3.可溶性淀粉合成酶(solublestarchsynthase，SSS)SSS主要分布在質(zhì)體基質(zhì)，催化支鏈淀粉α-1,4-糖苷鍵的形成，它有多種同工型?？扇苄缘矸酆铣擅赴⊿SS1、SSSII、SSSIII和SSSIV，它們主要參與支鏈淀粉的合成。SSSII有同工型SSSII-1、SSSII-2、SSSII-3；SSSIII有同工型SSSIII-1、SSSIII-2；SSSIV有同工型SSSIV-1、SSSIV-2；2/4/202314XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologySSS1主要負(fù)責(zé)合成短鏈，也即小于10個(gè)葡萄糖單位的鏈；進(jìn)一步的延伸由SSSII和SSSIII負(fù)責(zé)；在進(jìn)一步延伸之前，可能引入了分支。SSSII為支鏈淀粉晶體構(gòu)建所必需，它負(fù)責(zé)合成支鏈淀粉分支簇的主要成分——中等長度的葡聚糖鏈，對分支簇內(nèi)短鏈(A和B1鏈)延伸、B2和B3鏈合成起明顯作用，促進(jìn)晶體層的形成，影響淀粉的晶體模式2/4/202315XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologySSSⅢ與SSSⅡ相比，更傾向于合成長的B1和B2鏈(DP=25～35)(Edwards等，1999)。只在一個(gè)分支簇內(nèi)出現(xiàn)的B鏈稱B1鏈，連接2和3個(gè)分支簇的B鏈分別稱B2和B3鏈。2/4/202316XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologySchematicrepresentationofthegenethatcodesforricestarchsynthaseIIa(SSIIa)showingthepositionsofexons,intronsandsinglenucleotidepolymorphisms(SNPs).2/4/202317XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologySchematicrepresentationofstarchsynthaseIIa(SsIIa)showingthelocationofnonsynonymouspolymorphismsobservedincultivatedrice.Theboxesrepresentexonregions:shadedregionsaretranslated,andnonshadedregionsaretranscribedbutnottranslated.Linesconnectingboxescorrespondtointronregions.Thesizesofthegeneandsequencedregionareindicatedabovetheboxes.Thenumbers1,2and3indicatethelocationsofsinglenucleotidepolymorphisms(SNPs)1,2and3analyzedforphenotypicassociations.Bolditalicsequencesindicatecodonswithnonsynonymousmutations.2/4/202318XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologyGao等人用圖位克隆法獲得了控制稻米糊化溫度的基因ALK(SSII-3)，推測在翻譯起始密碼子ATG下游的G264突變?yōu)镃264與糊化溫度的高低有關(guān)；Bao等人對30個(gè)品種中SSIIa(SSII-3)基因中一段包括內(nèi)含子6，7和外顯子6，8，以及部分3′非翻譯區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行了測序分析，結(jié)合關(guān)聯(lián)分析檢測到在第8外顯子中GC/TT的變異對糊化溫度的變異具有較大的影響。2/4/202319XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology4.淀粉分支酶(starchbranchingenzyme，SBE)SBE的功能是通過斷開內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵并把釋放出來的還原性末端轉(zhuǎn)移到C6羥基上，從而產(chǎn)生α-1,6糖苷鍵。根據(jù)轉(zhuǎn)移的鏈長度可分為兩類：SBEI和SBEII。SBEI傾向于轉(zhuǎn)移長鏈，SBEII傾向于轉(zhuǎn)移短鏈。淀粉分支酶至少有3種同工型,即SBE1,SBE3和SBE4。2/4/202320XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology5.脫分支酶(debranchingenzyme，DBE)植物中存在著兩種類型的DBE，異淀粉酶（isoamylase）和極限糊精酶(pullulanase)，它們的功能都是水解α-1,6糖苷鍵，但它們的底物特異性不同。目前，脫分支酶(isoamylase和pullulanase)在淀粉合成中的確切功能還不清楚。2/4/202321XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology二、什么是RVA？稻米淀粉粘滯性一般用淀粉粘滯譜(又稱RVA譜)來表示，是指稻米淀粉勻漿在加熱、持續(xù)高溫和冷卻過程中粘度隨之變化而形成的曲線。稻米RVA譜是指稻米淀粉與一定量的水混合后，米漿在不同溫度下的黏度變化曲線。它可以比較靈敏地反映不同品種間淀粉的品質(zhì)差異。2/4/202322XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologyRVA特征指標(biāo)：一級指標(biāo)：最高粘度(peakviscosity，PKV)、熱漿粘度(hotpaste

viscosity，HPV)和冷膠粘度(coolpaste

viscosity，CPV)。二級指標(biāo)：崩解值(breakdownvalue，BDV，=PKV-HPV)、消減值(setbackvalue，SBV，=CPV-PKV)和回復(fù)值(consistencyvalue，CSV，=CPV-HPV)。2/4/202323XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology最高粘度(PKV,

peakviscosity)是由于充分吸水膨脹后的淀粉粒(又稱膨潤粒)互相摩擦而使米漿粘度增加所達(dá)到的最高值，它反映了淀粉的膨脹能力；熱漿粘度(HPV,hotpaste

viscosity)是由淀粉粒膨脹至極限后破裂，米漿粘度急劇下降所達(dá)到的值，它反映了淀粉在高溫下耐剪切能力，是影響食品加工操作難易的因素之一；2/4/202324XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology冷膠粘度(CPV,coolpaste

viscosity)是在溫度降低后被直鏈淀粉和支鏈淀粉包圍的水分子運(yùn)動變?nèi)醵姑诐{粘度再度上升后所達(dá)到的數(shù)值，冷膠粘度大則意味著室溫狀態(tài)下米漿粘度高，稻米煮成的飯就硬，具有這種特性的米煮成的飯也較硬。2/4/202325XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology澳大利亞的NewportscientificInstrument公司開發(fā)的粘度速測儀(RVA)，在谷物的淀粉粘度測定領(lǐng)域得到廣泛使用，許多研究表明，它用于評價(jià)稻米品質(zhì)是可行的。RVA儀用TCW配套軟件進(jìn)行分析，具有快速、簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等特點(diǎn)，而且RVA測定條件模擬稻米蒸煮過程，測定的RVA譜更能貼切地反映米飯口感和質(zhì)地，因而可望成為評價(jià)稻米食味品質(zhì)的適用技術(shù)。2/4/202326XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology稻米淀粉RVA譜主要受Wx基因控制(包勁松,等,1999)。由于稻米ECQs的主要指標(biāo)與RVA譜中除PKV外的其余特征值相關(guān)極顯著(賈良,等,2008;隋炯明,等,2005)，特別是BDV與GC的關(guān)系接近直線相關(guān)，AC和GC與RVA特征值相關(guān)系數(shù)分別高達(dá)0.919和0.905，RVA預(yù)測值與分析值十分接近(胡培松,等,2004)，因此，用RVA譜分析不同稻米的ECQs準(zhǔn)確可行。2/4/2023XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology27SummaryofgenescontrollingricegrainECQs(eatingandcookingqualities)AC~amylosecontent;GC~gelconsistency;GT~gelatinizationtemperature.2/4/202328XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology三、研究現(xiàn)狀研究表明,不同品種AC的高低由該品種Wx

基因第1內(nèi)含子的剪接效率所決定,而Wx

基因第1內(nèi)含子的剪接效率又與第1內(nèi)含子中供體+1位的堿基是正常的G或是突變的T有關(guān)。蔡秀玲等利用該位點(diǎn)上的G/T變異設(shè)計(jì)了可區(qū)分兩種基因型的“PCR-AccI”分子標(biāo)記，

而將Wx基因型分為GG型、TT型或GT型，其對應(yīng)的基因型分別為WxaWxa，

WxbWxb和WxaWxb。2/4/202329XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology孫華欽等建立了能用水平凝膠電泳檢測基因Wa、Wb的顯性STS標(biāo)記：Wi10-2和Wi10-1。2/4/202330XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology吳洪愷認(rèn)為：在其研究的4種基因(即SssI、SssII-3、SssIII-1和Sbe1)中，效應(yīng)最為明顯的為SssII-3。表現(xiàn)在該基因被蘇御糯的相應(yīng)基因置換以后形成的品系13，其RVA譜的主要特征值比糯稻品系11更接近于親本蘇御糯。表現(xiàn)在熱膠黏度、冷膠黏度和崩解值等特征值上。2/4/202331XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologyAssociatedgenesaffectingECQ（eatingandcookingquality）inthericestarchbiosynthesispathway.Thegenesmarkedinredweresignificant.Twomajorgenes,WxandSSII-3,werecircled.ASV(alkalispreadingvalue)~GT2/4/202332XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologyWxandSSII-3arecentralindetermininggrainECQsbyaffectingallthreeproperties:AC,GC,andGT.WxfunctionsasthesolemajorgeneforbothACandGCbutasaminorgeneaffectingGT,whereasSSII-3isthesolemajorgenecontrollingGTbutasaminorgeneaffectingACandGC.2/4/202333XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologyTwogenesaffecttwopropertiessimultaneously:bothISAandSBE3affectGCandGT.Severalminorgenesarespecificforeachproperty:SSIII-2,AGPlar,PUL,andSSIforAC,AGPisoforGC,andSSIV-2forGT.ThecorrelationsamongAC,GC,andGTwerecausedbythejointactionoftheseassociatedgenesandunequalhaplotypecombination.2/4/202334XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologyHaplotype=？Haplotype,acontractionof“haploidgenotype”,isthegeneticconstitutionofanindividualchromosome.Haplotypemayrefertoonlyonelocusortoanentiregenome.Inasecondmeaning,haplotypeisasetofsinglenucleotidepolymorphisms(SNPs)onasinglechromatidthatarestatisticallyassociated.Itisthoughtthattheseassociations,andtheidentificationofafewallelesofahaplotypeblock,canunambiguouslyidentifyallotherpolymorphicsitesinitsregion.2/4/2023XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology35EffectsofWxandSSII-3ongrainECQsinrice.(A)WxfunctionsasamajorgenecontrollingAC.(B)WxfunctionsasamajorgenecontrollingGC.(C)SSII-3functionsasamajorgenecontrollingGT.(D)SSII-3alsofunctionsadditivelywithWxtocontrolgrainAC.(E)WxworkswithSSII-3incontrollinggrainGT.(F)ThehaplotypecombinationofWxandSSII-3.2/4/202336XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnologyWx基因變異是導(dǎo)致水稻AC變異最主要的原因目前Wx基因的序列變異已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在于：(1)Wx基因5′端非翻譯區(qū)第一外顯子CT多態(tài)性

((CTn)alleles)(Blighetal.,1995)；(2)Wx基因第一內(nèi)含子G/T多態(tài)性(In1G/TSNP)(Caietal.,1998)；(3)Wx基因第四外顯子A/G多態(tài)性(Ex4A/GSNP)(Mikamietal.,2008)；(4)Wx基因第六外顯子A/C多態(tài)性(Ex6A/CSNP)；(5)第10外顯子的C/T多態(tài)性(Ex10C/TSNP)(LarkinandPark,2003)。2/4/2023XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology37現(xiàn)有水稻資源中出現(xiàn)的四個(gè)單倍型In1G-Ex6A(高AAC)、In1G-Ex6C(中等程度的AAC)、In1T-Ex6A(低AAC)、In1T-Ex6C(僅存在于糯稻)對ECQs改良具有指導(dǎo)作用。2/4/2023XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology38通過對現(xiàn)有水稻資源Wx基因等位變異檢測和其直鏈淀粉含量的相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)In1G/TSNP和Ex6A/CSNP二個(gè)位點(diǎn)變異對水稻胚乳直鏈淀粉含量影響最大(Chenetal.,2008a,2008b)。2/4/2023XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology39SSSII-3(SSSIIa)基因變異是導(dǎo)致水稻GT變異最主要的原因目前SSSII-3基因的序列變異已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在于：(1)SSSII-3基因的第一外顯子(Ex1G/CSNP,Glu/Asp)；(2)第八外顯子(Ex8A/GSNP,Ser/Gly)；(3)第八外顯子(Ex8A/GSNP,Met/Val)；(4)第八外顯子(Ex8GC/TT,Leu/Phe)(Umemotoetal.,2004)。2/4/2023XunchaoXiangSouthwestUniversityofScienceandTechnology40現(xiàn)有水稻資源中發(fā)現(xiàn)四個(gè)單倍型：單倍型1(Ex8G/Ex8G/Ex8GC)和單倍型2(Ex8A/Ex8G/Ex8GC)有高的GT，單倍型3(Ex8A/Ex8A/Ex8GC)和單倍型4(Ex8A/Ex8G/Ex8TT)有低的GT(Umemotoetal.,2005;Watersetal.,2006)。2/4/2023XunchaoXiangSouthwestUniversityofScien