第五章分子生物學(xué)研究法(上)3

分子生物學(xué)基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)

第五章

扉頁(yè)：當(dāng)你進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，要像脫去外衣那樣放下你的想象力，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作中不能有一丁點(diǎn)兒的想象，否則，你對(duì)事物的觀察就會(huì)受影響；當(dāng)你翻開(kāi)書本的時(shí)候，你又必須盡可能展開(kāi)想象的“翅膀”，否則，你就不可能走在別人的前面。5.4SNP的理論與應(yīng)用SNP的定義定義：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。

是第三代遺傳標(biāo)記。5.4.1SNP概述單倍型：是指位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)。SNP分類：cSNP同義cSNP非同義cSNPpSNPrSNP基因調(diào)控區(qū)SNP基因間隨機(jī)非編碼區(qū)SNP基因編碼區(qū)SNP5.4.2SNPs經(jīng)典檢測(cè)方法一大類是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測(cè)方法,如:1.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法PCR-RFLP;2.單鏈構(gòu)象多態(tài)性法PCR-SSCP;3.變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgeleletrophoresisDGGE);4.等位基因特異性PCR(allelespecificPCR,ASPCR)等等PCR-RFLP方法

原理：利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶作用于同一DNA片斷，如果存在SNP位點(diǎn)，酶切片斷的長(zhǎng)度和數(shù)量則會(huì)出現(xiàn)差異，根據(jù)電泳的結(jié)果就可以判斷是否SNP位點(diǎn)。特點(diǎn)：該技術(shù)應(yīng)用的前提是SNP的位點(diǎn)必須含有該限制內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，它是SNP篩查中最經(jīng)典的方法之一.PCR-RFLP原理圖單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)

原理：?jiǎn)捂淒NA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)在電泳中會(huì)出現(xiàn)不同的遷移率。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴于堿基的組成，單個(gè)堿基的改變也會(huì)影響其構(gòu)象，最終會(huì)導(dǎo)致在凝膠上遷移速度的改變。在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其單堿基序列的不同而形成不同的構(gòu)象，這樣在凝膠上的遷移速率不同，出現(xiàn)不同的條帶，檢測(cè)SNP。特點(diǎn)：由于該方法簡(jiǎn)單快速，因而被廣泛運(yùn)用于未知基因突變的檢測(cè)。這種方法的弊端在于不能確定突變類型和具體位置。變性梯度凝膠電泳（DGGE）原理：是利用長(zhǎng)度相同的雙鏈DNA片段解鏈溫度不同的原理,通過(guò)梯度變性膠將DNA片段分開(kāi)的電泳技術(shù)。電泳開(kāi)始時(shí),DNA在膠中的遷移速率僅與分子大小有關(guān),而一旦DNA泳動(dòng)到某一點(diǎn)時(shí),即到達(dá)該DNA變性濃度位置時(shí),使得DNA雙鏈開(kāi)始分開(kāi),從而大大降低了遷移速率。當(dāng)遷移阻力與電場(chǎng)力平衡時(shí),DNA片段在凝膠中基本停止遷移。由于不同的DNA片段的堿基組成有差異,使得其變性條件產(chǎn)生差異,從而在凝膠上形成不同的條帶。等位基因特異PCR(AS-PCR)原理：根據(jù)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物,其中一條鏈(特異鏈)的3′末端與SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)(或相同),另一條鏈(普通鏈)按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計(jì),因此,AS-PCR技術(shù)是一種基于SNP的PCR標(biāo)記。因?yàn)樘禺愐镌谝环N基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物,在另一種基因型中沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物,用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú),從而確定基因型的SNP。

5.4.3SNPs高通量的檢測(cè)方法

另一大類檢測(cè)方法是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的,高通量、自動(dòng)化程度較高的檢測(cè)SNPs的方法,較為常用的有:1.DNA測(cè)序法;2.DNA芯片檢測(cè);3.飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)檢測(cè);4.變性高效液相色譜(DHPLC)法等等DNA測(cè)序法直接測(cè)序是最容易實(shí)施的SNP檢測(cè)方法。原理:

通過(guò)對(duì)不同個(gè)體同一基因或基因片段進(jìn)行測(cè)序和序列比較,以確定所研究的堿基是否變異,其檢出率可達(dá)100%。特點(diǎn)：可以得到SNP的類型及其準(zhǔn)確位置等SNP分型所需要的重要參數(shù)?；蛐酒夹g(shù)(Genechips)

原理:是將具有特定堿基序列的探針固定在特殊的載體上，待測(cè)基因經(jīng)提取、熒光標(biāo)記后，與固定好的探針進(jìn)行雜交，最后根據(jù)熒光的強(qiáng)度和種類測(cè)出待測(cè)序列的堿基類別。

特點(diǎn)：基因芯片具有信息量大和自動(dòng)化程度高的突出優(yōu)點(diǎn)。但它也存在若干問(wèn)題:芯片造價(jià)高昂,所需設(shè)備貴重,不利于普及應(yīng)用。MALDI-TOF

原理：是將變性的單鏈PCR產(chǎn)物通過(guò)與硅芯片上的化合物共價(jià)結(jié)合后,在硅芯片上進(jìn)行引物的退火,延伸反應(yīng),突變部位配對(duì)的堿基與正常配對(duì)的堿基不相同。根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰而檢測(cè)SNP。變性高效液相色譜(DHPLC)原理：目標(biāo)核酸片段PCR擴(kuò)增，部分加熱變性后，含有突變堿基的DNA序列由于錯(cuò)配堿基與正常堿基不能配對(duì)而形成異源雙鏈。因包含錯(cuò)配堿基的雜合異源雙鏈區(qū)比完全配對(duì)的同源配對(duì)區(qū)和固定相的親和力弱，更易被從分離柱上洗脫下來(lái),從而達(dá)到分離的目的。SNPs的有無(wú)最終表現(xiàn)為色譜峰的峰形或數(shù)目差異,依據(jù)此現(xiàn)象可很容易從色譜圖中判斷出突變的堿基。特點(diǎn)：使用高效液相色譜檢測(cè)SNPs具有檢測(cè)效率高，便于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)未知SNPs的準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上。但DHPLC檢測(cè)對(duì)所用試劑和環(huán)境要求較高,容易產(chǎn)生誤差,不能檢測(cè)出純合突變。

SNP及突變研究的最新工具

高分辨率熔解曲線

（HighResolutionMelting）

HighResolutionDNAMelting（HRM)是基于有序列變化的Amplicon之間微弱的Tm值差異，通過(guò)DNA片段熔解曲線的差異進(jìn)行突變檢測(cè)，比如：5.4.4SNP的應(yīng)用1.人類基因單體型圖的繪制2.SNP與疾病易感基因的相關(guān)性分析3.指導(dǎo)用藥與藥物設(shè)計(jì)Gene

SNPbybioinformatics真核生物基因組龐大，含有大量重復(fù)序列。無(wú)論是電泳分離技術(shù)還是通過(guò)雜交的方法，都難以直接分離到目的基因片段。盡管高等生物一般具有3-5萬(wàn)種左右不同的基因，在單個(gè)細(xì)胞或組織的特定時(shí)間段中，僅有15-20%左右的基因得以表達(dá)。5.5基因克隆技術(shù)cDNA克隆的基本過(guò)程是通過(guò)一系列酶催作用，使總poly（A）mRNA轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主菌株細(xì)胞，構(gòu)成包含所有基因編碼序列的cDNA基因文庫(kù)。

基因工程基本步驟

目的DNA制備；載體DNA選擇

↓

DNA體外重組技術(shù)

↓（DNA酶切實(shí)驗(yàn)、連接實(shí)驗(yàn)）

重組DNA的轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)染）試驗(yàn)

↓

重組克隆的篩選與鑒定

（重組體的表型篩選，指紋圖譜法，

PCR方法，探針雜交法）

↓

目的基因表達(dá)產(chǎn)物的篩選與鑒定

（遺傳互補(bǔ)法，免疫化學(xué)法－Western印雜交法，微細(xì)胞法(microcellmethod)

基因工程流程示意圖5.5.1

RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)是用于從已知cDNA片段擴(kuò)增全長(zhǎng)基因的方法，它根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)基因片段內(nèi)部特異引物，由該片段向外側(cè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的序列。用于擴(kuò)增5’端的方法稱為5’RACE，用于擴(kuò)增3’端的稱為3’RACE。5’RACE1.在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以已知基因片段內(nèi)部。特異性引物啟始cDNA第一條鏈的合成2.RNase混合物降解模板mRNA，純化cDNA第一條鏈。3.用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA鏈3‘端加入連續(xù)的dCTP4.以連有oligo(dG)的錨定引物和基因片段內(nèi)部特異的nested引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以期得到目的片段，并可用nestPCR進(jìn)行檢測(cè)。3’RACE1.在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以連有可以和polyA配對(duì)的oligo(dT)的錨定引物啟始cDNA第一條鏈的合成。2.用RNaseH降解模板mRNA。3.用通用錨定引物和基因片段內(nèi)部特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的3‘片段，并可用nestPCR的方法繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)和擴(kuò)增。5.5.2應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因該法通過(guò)降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴(kuò)增目的基因片段。因?yàn)門ester和Driver在接受差示分析前均經(jīng)一個(gè)4堿基切割酶處理，形成平均長(zhǎng)度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。每次T減D反應(yīng)后僅設(shè)置72℃復(fù)性與延伸，94℃變性這兩個(gè)參數(shù)共20個(gè)PCR循環(huán)，PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度非常高。RDA流程圖。5.5.3TA載體TopoTA載體InvitrogenProprietary&Confidential38DifferentwaystogeneratetheentrycloneTOPO?CloningTOPO?BPClonase?BPCloningPCRProduct+TOPO-ActivatedEntryVectorL1L2Gene+attBPCRProductB2GeneB1DonorVectorP2ccdBP1EntryCloneL2GeneL1+digestedDNAFragmentGeneB1digestedEntryVectorL2L14.Pre-madeentryclone5.Custom-madeentrycloneLigaseRestriction/LigaseCloningORFCollectionL2ORFL1MultiSiteGateway?-ExtendingtheapplicationsYourApplicationGene1Gene2Gene3Gene4YourApplicationGeneProteinLocalizationGeneGeneProteinPurificationGeneRNAiGeneCell-FreeGeneProtein

interactionGeneGeneEntryClonePCRGenesynthesisORFcollectionLibraryYourSourceGateway大規(guī)模克隆技術(shù)大量的基因組序列被測(cè)定，要闡明這些基因的功能需要將不同的可譯框架連入載體，傳統(tǒng)的方法不能滿足大規(guī)?？寺〉男枰ateway基因大規(guī)?？寺》ǎ豪忙耸删w進(jìn)行位點(diǎn)特異性DNA片段重組，實(shí)現(xiàn)了基因快速克隆和載體間平行轉(zhuǎn)移。Gateway克隆技術(shù)主要包括：TOPO反應(yīng)和LR反應(yīng)TOPO反應(yīng)：將目的基因PCR產(chǎn)物連入Entry載體；LR反應(yīng)：被用于將目的片段從Entry載體中重組入表達(dá)載體。Entry載體上的CCCTT被拓?fù)洚悩?gòu)酶識(shí)別，切開(kāi)后通過(guò)274位酪氨酸與切口處的磷酸基團(tuán)形成共價(jià)鍵，加入PCR產(chǎn)物后，形成的3’突出端GTGG,攻擊PCR產(chǎn)物的互補(bǔ)性末端并與接頭序列CACC退火，切去GTGG后使PCR產(chǎn)物以正確方向連入Entry載體5.5.4基因的圖位克隆

（Map-basedcloning）所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過(guò)該方法克隆得到。首先，通過(guò)構(gòu)建遺傳連鎖圖，將目的基因定位到某個(gè)染色體的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記。通過(guò)對(duì)許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記，通過(guò)染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來(lái)。圖5-25染色體步移法克隆基因示意圖5.6蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)1995年，首次發(fā)表關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)（proteome）概念的論文。蛋白質(zhì)組是指一個(gè)基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學(xué)是指在蛋白質(zhì)組水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯與修飾、蛋白與蛋白相互作用等，并由此獲得相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展及細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體認(rèn)識(shí)5.6.1雙向電泳技術(shù)5.6.2蛋白質(zhì)印跡法5.6.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù)5.6.1雙向電泳技術(shù)等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing,IFE）

利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場(chǎng)作用下在凝膠內(nèi)沿電場(chǎng)方向制造一個(gè)pH梯度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）在有去污劑十二烷基硫酸鈉存在下的聚丙烯酰胺凝膠電泳。依賴于蛋白質(zhì)的兩個(gè)性質(zhì)：等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品在這樣的凝膠上電泳時(shí)，每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI相一致的pH處，具有不同pI的各種蛋白質(zhì)最后都遷移至凝膠中相應(yīng)的pH處，達(dá)到分離的目的。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，SDS負(fù)電荷掩蓋或消除了不同種類蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在SDS聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)分子量大小。如果將等電聚焦電泳與SDS結(jié)合起來(lái)，就是分辨率更高的雙向電泳。雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色蛋白呈現(xiàn)二維分布圖，水平方向反映出蛋白在pI上的差異，而垂直方向反映出它們?cè)诜肿恿可系牟顒e。所以雙向電泳可以將分子量相同而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)以及等電點(diǎn)相同而分子量不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)。5.6.2蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法（Westernbloting），又稱免疫印跡法（immunoblotling）原理：據(jù)被測(cè)蛋白能與特異性抗體結(jié)合的特性和該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。特點(diǎn)：高效、簡(jiǎn)便、靈活等蛋白質(zhì)樣品電泳非標(biāo)記抗體（一抗）發(fā)生免疫反應(yīng)熒光素酶或放射性同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)通過(guò)顯色或放射自顯影法檢測(cè)凝膠中的蛋白質(zhì)成分轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素薄膜）方法：圖5－28免疫印跡法示意圖封閉影響免疫印跡法成敗的因素：主要因素是：抗原分子中可被抗體識(shí)別的表位信息。第二個(gè)因素：蛋白原液中抗原的濃度用于檢測(cè)的二級(jí)抗體一般分為以下三種1.放射性標(biāo)記的抗體2.與酶偶聯(lián)的抗體：主要包括：辣根過(guò)氧化物酶堿性磷酸酯酶3.與生物素相偶聯(lián)的抗體westernblot實(shí)驗(yàn)步驟視頻WesternBlot-SNAPi.dSystem5.6.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù)基質(zhì)輔助的激光解析電離－飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）質(zhì)譜基礎(chǔ)

樣品離子源質(zhì)量分析器離子檢測(cè)器固體液體蒸汽形成離子(帶電分子)電離質(zhì)量分選(過(guò)濾)檢測(cè)根據(jù)m/z分選離子數(shù)據(jù)處理質(zhì)譜檢測(cè)離子基本步驟:1.樣品離子化2.根據(jù)質(zhì)量(m/z)不同分離離子3.檢測(cè)每種質(zhì)量離子的數(shù)目4.收集、處理數(shù)據(jù)得到質(zhì)譜圖質(zhì)譜的評(píng)價(jià)指標(biāo)質(zhì)量范圍速度靈敏度分辨率精確度+++自由漂移區(qū)檢測(cè)器基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)樣品探針激光335nmm/z相對(duì)強(qiáng)度MH+MH+MH+特點(diǎn)：靈敏度高準(zhǔn)確度高分辨率高質(zhì)量范圍