多聚酶鏈式反應擴增DNA片段-

多聚酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR技術)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為DNA體外擴增技術。課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段溫故知新1:組成DNA分子的基本單位是什么?這些基本單位是如何連接成DNA分子的?DNA分子結構有什么特點？12345DNA的基本單位－脫氧核苷酸OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基堿基脫氧核糖磷酸基團堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’脫氧核苷酸鏈結構簡圖磷酸二酯鍵ATGCAGCTDNA分子的平面結構氫鍵5'端3'端5'端3'端DNA分子的復制過程是怎樣的？DNA分子的復制需要哪些條件？溫故知新2DNA母鏈：提供復制的模板解旋酶：打開DNA雙鏈4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈ATP：為復制過程提供能量引物：使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸DNA復制的條件復制特點半保留復制，邊解旋邊復制，多起點復制。DNA復制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸1、DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物2、DNA聚合酶作用過程當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸一、基礎知識

（一）PCR原理：①在80～100℃的溫度范圍內，DNA的雙螺旋結構將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性3、PCR原理②當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結合成雙鏈③PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質上也是一臺能夠自動調控溫度的儀器高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術的自動化4、TaqDNA聚合酶的應用5、緩沖液需要為PCR反應提供的物質DNA模板，分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行PCR技術是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出6、PCR技術的特點①PCR過程需要的引物是RNA或DNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為20－30個脫氧核苷酸7、細胞內復制和PCR不同點②PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的細胞內DNA的復制PCR不同點解旋解旋酶，邊解旋邊復制80～100℃高溫解旋，雙鏈完全分開酶DNA解旋酶，DNA聚合酶，DNA連接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加溫度體內溫和條件高溫子鏈合成一條鏈連續(xù)（先導鏈），另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再由DNA連接酶連接（滯后鏈）兩條子鏈均連續(xù)合成相同點①需要提供DNA復制模板②四種脫氧核苷酸作為原料③子鏈延伸的方向都是從5’端到3’端細胞內DNA的復制與PCR的比較PCR技術的原理總結利用DNA分子的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結合，從而完成體外DNA分子的擴增。體外DNA復制的條件：四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、模板；緩沖溶液和嚴格控制溫度的溫控設備。復制的方向：子鏈的5’端向3’端延伸。（二）PCR的反應過程1、PCR的反應步驟PCR一般經歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟──變性、復性和延伸①變性（模板DNA解旋）模板DNA經加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結合，為下輪反應作準備2、循環(huán)過程靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性②復性（退火）模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火③延伸DNA模板－引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復制的原理，合成一條新的DNA鏈靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸靶序列靶序列第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個拷貝的靶序列3、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量1

22

43

820

1,048,57630

1,073,741,824二、PCR的反應過程小結5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次復制第一次復制55

55

5

5模板DNA55

555

5

5525～30次循環(huán)（復制）后，模板DNA的含量可以擴大100萬（220）倍以上。每個循環(huán)包括：變性——復性——延伸從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產物也可以作為模板參與反應，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結合，進行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。PCR的反應過程：PCR反應條件：

①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境②DNA模板③分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物④A、T、G、C四種脫氧核苷酸

⑤耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶

⑥能嚴格控制溫度變化的溫控設備三、PCR的實驗操作1、PCR儀（一）設備及用具實質上一臺能夠自動調控溫度的儀器2、微量離心管一種薄壁塑料管，總容積為0.5ml3、微量移液器用于定量轉移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次PCR儀微量離心管微量移液器1、準備2、移液（二）實驗操作步驟按照PCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上用微量移液器按照PCR反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑①過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。②注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應液混合均勻。A、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢。將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序。①過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s。4、離心5、反應②離心目的：使反應液體集中在離心管底部，提高反應效果。PCR三步曲預變性保溫變性94℃30s延伸72℃1min復性55℃30s94℃5min循環(huán)數(shù)變性復性延伸預變性94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR技術高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6、注意事項①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；②PCR所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算四、課題成果評價1、一條DNA，復制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復制n次，DNA為ax2n（二）實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關稀釋2μLPCR反應液，加入98L蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋對照調零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調節(jié)至零測定取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值計算DNA含量（g/ml）＝50×(260nm的讀數(shù)）×稀釋倍數(shù)2.過程比色杯五、實驗小結

PCR儀加熱使（）變性,復性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（）為復制的起點,合成新鏈。如此重復改變反應溫度,經（）三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴增產物進行電泳,經溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。模板互補Taq聚合酶四種脫氧核苷酸引物變性、復性和延伸72℃1.提示