細(xì)胞衰老與凋亡

細(xì)胞衰老與凋亡第一節(jié)細(xì)胞衰老一、Hayflick界限：細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的脂質(zhì)能力不是無限的，而是有一定的界限衰老是細(xì)胞本身決定的還是由于培養(yǎng)環(huán)境的惡化？以間期有無巴氏小體作為供體細(xì)胞的標(biāo)記，將取自老年男性個體的細(xì)胞和取自年輕女性個體的細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)和混合培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)其倍增次數(shù)。結(jié)果：混合培養(yǎng)中的兩類細(xì)胞的倍增次數(shù)與各自單獨(dú)培養(yǎng)時相同。

說明決定細(xì)胞衰老的因素在細(xì)胞內(nèi)部。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)是細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)決定了細(xì)胞衰老二、細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老近交系小鼠皮膚移植實(shí)驗(yàn)結(jié)論：引起小鼠皮膚細(xì)胞在體內(nèi)衰老的主要是體內(nèi)環(huán)境。更新組織：如上皮細(xì)胞、血細(xì)胞。構(gòu)成更新組織的細(xì)胞可分為３類：①干細(xì)胞、②過渡細(xì)胞、③成熟細(xì)胞。穩(wěn)定組織：可補(bǔ)償性增生，如：肝、腎細(xì)胞。恒久組織：細(xì)胞不再分裂，如神經(jīng)細(xì)胞。可耗盡組織：如人類的卵巢實(shí)質(zhì)細(xì)胞三、細(xì)胞衰老的特征（一）細(xì)胞核的變化核增大最明顯的變化是核膜內(nèi)折另一個重要變化是染色質(zhì)固縮【與染色質(zhì)蛋白的二硫鍵有關(guān)】核仁裂解為小體（二）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化（三）線粒體的變化粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量減少，排列無序線粒體的數(shù)量隨年齡增大而減少，體積隨年齡增大而增大在培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞中有兩種線粒體：Ⅰ型固縮緊密；Ⅱ型大而稀疏（五）膜系統(tǒng)的變化（四）致密體的生成衰老細(xì)胞中常見的一種結(jié)構(gòu)，絕大多數(shù)動物細(xì)胞在衰老是都會有致密體的積累其他名稱：脂褐質(zhì)【通常產(chǎn)生自發(fā)熒光，是自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物】、老年色素、血褐質(zhì)、黃色素、透明蠟體及殘?bào)w等等來源：溶酶體【多數(shù)。單層膜，有陽性磷酸酶反應(yīng)】或線粒體【少數(shù)】轉(zhuǎn)化年輕的功能齊全的細(xì)胞的膜相是典型的液晶相衰老的或有缺陷的膜通常處于凝膠相或固相【磷脂的脂肪酸尾不能自由移動】細(xì)胞衰老時，細(xì)胞間間隙連接及膜內(nèi)顆粒的分布也發(fā)生變化P面膜內(nèi)顆粒明顯減少，E面顆粒相對增加，但總顆粒數(shù)變化不顯著細(xì)胞間間隙連接減少分子水平的變化1.

DNA：復(fù)制與轉(zhuǎn)錄受阻，端粒DNA、mtDNA缺失。DNA氧化、斷裂、缺失和交聯(lián)，甲基化程度降低。2.

RNA：含量減少。3.

蛋白質(zhì)：含成下降，發(fā)生修飾、交聯(lián)。4.

酶分子：物理與化學(xué)特征改變，酶失活。5.

脂類：不飽和脂肪酸被氧化。三、細(xì)胞衰老的分子機(jī)理（一）氧化損傷學(xué)說觀點(diǎn)：代謝中產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子（ROS）引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導(dǎo)致衰老。ROS主要有三種類型：1.超氧自由基；2.羥自由基；3.過氧化氫內(nèi)源性自由基產(chǎn)生于①由線粒體呼吸鏈電子泄漏產(chǎn)生；②由氧化酶（如MFO）催化底物羥化產(chǎn)生來源：外源性（如輻射）、內(nèi)源性。自由基可引起DNA、蛋白質(zhì)、脂類氧化、變性和交聯(lián)，實(shí)驗(yàn)表明DNA中OH8dG隨著年齡而增加。正常細(xì)胞內(nèi)存在清除自由基的防御系統(tǒng)。酶系統(tǒng)：SOD、CAT、GSH-PX。非酶系統(tǒng)：維生素E、醌類電子受體Orr和Sohal（1994），將SOD基因?qū)牍?，其壽命比野生型延長1/3。（二）端粒學(xué)說端粒酶：是一種核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成。端粒酶RNA是合成端粒DNA的模板，而端粒酶的反轉(zhuǎn)錄酶亞基則催化端粒DNA的合成有絲分裂鐘學(xué)說【Harley】：隨著細(xì)胞的每次分裂，端粒不斷縮短；當(dāng)端粒長度縮短達(dá)到一個閾值時，細(xì)胞就進(jìn)入衰老Wright等的證據(jù)細(xì)胞衰老指標(biāo)：β半乳糖苷酶活性（三）rDNA與衰老（四）沉默信息調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物與衰老（五）SGS1基因、WRN基因與衰老適用于哺乳類中由分裂細(xì)胞組成的組織酵母中發(fā)現(xiàn)通過同源重組產(chǎn)生的第一份環(huán)狀rDNA片段會澎沖而出，成為染色體外rDNA環(huán)【ERC】，隨細(xì)胞分裂不斷進(jìn)行，ERC不斷復(fù)制增加，到一定程度，細(xì)胞衰老類型：簡稱Sir復(fù)合物，包括Sir1、Sir2、Sir3、Sir4。分布：通常存在于異染色質(zhì)中。一方面與RAP1和組蛋白H3/H4結(jié)合；一方面附在核基質(zhì)上。酵母中，Sir復(fù)合物通常存在于端粒及性別決定有關(guān)的HML和HMR位點(diǎn)上功能：阻止它們所在位點(diǎn)的DNA轉(zhuǎn)錄。酵母中發(fā)現(xiàn)一種sgs1突變體【SGS1基因缺陷或喪失】，壽命短于野生型。該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于RecQ亞族的DNA解旋酶。集中在核仁。核仁若缺少該蛋白就會裂解。Werner綜合癥【引發(fā)早老的疾病】：WRN基因與SGS1基因同源，編碼的蛋白質(zhì)具有7個DNA解旋酶所特有的標(biāo)志序列，位于核仁。Werner'ssyndromeA37yearsoldpatient，AdoueDFP1997Hutchinson-Gilfordsyndrome（六）發(fā)育程序與衰老（七）線粒體DNA與衰老線蟲在發(fā)育過程中遇到不良環(huán)境，引起性外激素濃度的變化，結(jié)果幼蟲就進(jìn)入一種特殊的稱為dauer幼蟲階段，可延續(xù)6個月之久。全身被以厚的角質(zhì)層，口緊閉，處于休眠狀態(tài)。兩類相關(guān)基因，稱為daf基因?！镜谝活悾篸af2和ade1基因；第二類：daf16基因】daf2基因編碼類胰島素受體；age1編碼磷脂酰肌醇-3-激酶的p110催化亞基；daf16編碼一種轉(zhuǎn)錄活化劑【不良環(huán)境時表達(dá)】第二節(jié)細(xì)胞凋亡二、細(xì)胞凋亡的意義：對于多細(xì)胞生物個體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用一、細(xì)胞凋亡的概念：是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程。也稱細(xì)胞編程性死亡（PCD）細(xì)胞凋亡的失調(diào)包括不恰當(dāng)?shù)募せ詈鸵种茣?dǎo)致疾病，如Alzheimer氏病、各種腫瘤、艾滋病以及自身免疫病三、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征（一）細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死二者的主要區(qū)別：細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞膜反折，包裹斷裂的染色質(zhì)片段或細(xì)胞器，然后逐步分離，形成眾多的凋亡小體，凋亡小體被鄰近的細(xì)胞所吞噬，整個過程細(xì)胞膜的整合性良好，細(xì)胞內(nèi)容物不會逸散到胞外環(huán)境，因而不引發(fā)炎癥反應(yīng)。細(xì)胞壞死時，細(xì)胞膜發(fā)生滲漏，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，引起炎癥反應(yīng)。細(xì)胞壞死：細(xì)胞受到環(huán)境因素傷害，引起細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。細(xì)胞壞死初期，胞質(zhì)內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、崩解，結(jié)構(gòu)脂滴游離、空泡化，蛋白質(zhì)顆粒增多，核發(fā)生固縮或斷裂。隨壞死進(jìn)程，細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)嗜酸性，蘇木精/伊紅染色呈均一紅色。細(xì)胞膜不完整，臺盼藍(lán)染色陽性(活細(xì)胞不著色)。DNA隨機(jī)降解，細(xì)胞內(nèi)容物流出，引起炎癥。形態(tài)變化的原因：酶性消化、蛋白變性。如消化酶來源于死亡細(xì)胞本身的溶酶體，則稱為自溶；若來源于浸潤壞死組織內(nèi)白細(xì)胞溶酶體，則為異溶。細(xì)胞凋亡①細(xì)胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體；②凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器；③不引起炎癥；④線粒體無明顯形態(tài)變化，溶酶體活性不增加；⑤內(nèi)切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖呈梯狀；⑥凋亡通常是生理性變化，壞死是病理性變化。（二）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征三個階段：1.凋亡的起始：細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞間接觸消失；細(xì)胞膜依然完整，有選擇透過性；細(xì)胞質(zhì)中，線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)，沿核膜分布2.凋亡小體的形成：染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器一起聚集，為反折的細(xì)胞膜所包圍。細(xì)胞表面產(chǎn)生許多泡狀或芽狀突起，后逐漸分隔，形成當(dāng)?shù)蛲鲂◇w3.凋亡小體逐漸被鄰近的細(xì)胞所吞噬并消化（三）細(xì)胞凋亡的生化特征1.DNA發(fā)生核小體間的斷裂，結(jié)果產(chǎn)生含有不同數(shù)量核小體單位的片段，在瓊脂糖凝膠電泳時，形成特征性的梯狀條帶【鑒定細(xì)胞凋亡的最可靠方法】。催化DNA降解的是依賴Ca2+/Mg2+的核酸內(nèi)切酶【Zn2+抑制其活性】2.tTG（組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，依賴鈣離子）的積累并達(dá)到較高水平【tTG催化某些蛋白的翻譯后修飾，主要通過建立谷氨酰胺和賴氨酸之間的交聯(lián)以及多胺摻入蛋白質(zhì)而實(shí)現(xiàn)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚合】/胸腺細(xì)胞正常凋亡胸腺細(xì)胞正常凋亡（四）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子物理因子化學(xué)及生物因子（五）細(xì)胞凋亡的檢測基于凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征，特別是DNA的斷裂1.形態(tài)學(xué)觀測：DAPI【與DNA結(jié)合的熒光染料】染色，可觀察到細(xì)胞核的形態(tài)變化Giemsa染色可以觀察到染色質(zhì)固縮、趨邊、凋亡小體的形成透視和掃描電鏡觀察凋亡細(xì)胞細(xì)胞核的形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化吖啶橙（AO）和溴乙錠（EB）復(fù)染【AO只進(jìn)入活細(xì)胞，正常細(xì)胞核及處于凋亡早期的細(xì)胞核呈綠色；EB只能進(jìn)入死細(xì)胞，染成橙紅色】2.DNA電泳梯狀條帶3.TUNEL測定法【DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法】4.彗星電泳法【快速簡便】原理：將單個細(xì)胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處理后，再在電場中短時間電泳，并用熒光染料染色，凋亡細(xì)胞中形成的DNA降解片段，泳動速度快，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗星式圖案5.流式細(xì)胞分析原理：根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙錠使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光后檢測細(xì)胞程序性死亡細(xì)胞程序性死亡（PCD）是一種基因指導(dǎo)的細(xì)胞自我消亡方式。PCD和細(xì)胞凋亡的區(qū)別在以下方面：PCD是功能性概念，凋亡是形態(tài)學(xué)概念。PCD的最終結(jié)果是凋亡，但凋亡并非都是程序化的。PCD存在于胚胎發(fā)育過程中。四、細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理1.capase家族分布：胞質(zhì)溶膠中是半胱氨酸蛋白酶重要共同點(diǎn)：特異性斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵Capase的研究源于線蟲細(xì)胞程序化死亡的研究控制線蟲PCD的基因有：Ced-3、Ced-4和Ced-9。

Ced-3和Ced-4誘發(fā)凋亡；Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用哺乳類細(xì)胞中存在Ced3的同源物ICE，它催化白介素1β的活化Apopain催化PERP【聚（ADP核糖）聚合酶】裂解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Apopain被稱為“死亡酶”，PERP為“死亡底物”Ced4的哺乳類同源物為Apaf-1【一種細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子】Ced9的哺乳類對應(yīng)物為Bcl-2Apaf-1凋亡酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1），線蟲的同源物為ced-4。作用：參與線粒體凋亡途徑，該基因敲除后，小鼠神經(jīng)細(xì)胞過多，腦畸形發(fā)育。Apaf-1與cytc、ATP/dATP結(jié)合后，召集caspase-9，形成凋亡體（apoptosome），激活caspase-3，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)。bcl-2基因家族含有1-4個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH1-4）。分兩類：抗凋亡基因，如：Bcl-2；促凋亡基因，如：Bax。促凋亡蛋白能引起線粒體外膜通透性改變，導(dǎo)致cytc釋放，引起凋亡。bcl-2相當(dāng)于線蟲的ced9。主要定位于線粒體膜、也存在于ER和外核膜，拮抗促凋亡蛋白的功能。Fas

fas又稱作APO-1，屬TNF受體家族。1993年人白細(xì)胞分型國際會議統(tǒng)一命名為CD95。fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結(jié)合激活caspase。P53基因組的守護(hù)者。輻射誘導(dǎo)的DNA損傷可通過ATM激活p53，阻斷細(xì)胞周期，并提高Fas的表達(dá)，誘導(dǎo)凋亡。Myc轉(zhuǎn)錄因子，生長因子存在，Bcl-2基因表達(dá)時，促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之引起細(xì)胞凋亡。ATM是DNA損傷檢驗(yàn)的重要蛋白激酶，能激活P53。2.Capase的活化細(xì)胞中合成的Capase以無活性的酶原狀態(tài)存在凋亡起始者Capase2,8,9,10凋亡執(zhí)行者Capase3,6,7起始者活化執(zhí)行者Cap