第三章+微生物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

第三章微生物細(xì)胞培養(yǎng)與控制技術(shù)第一部分：培養(yǎng)技術(shù)少量培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)淺層培養(yǎng)厚層或深層液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)靜止培養(yǎng)通氣攪拌液體培養(yǎng)單批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)到多級培養(yǎng)分散固定化細(xì)胞野生菌種突變、遺傳工程菌種單菌發(fā)酵混菌發(fā)酵低密度高密度人工控制發(fā)酵罐多傳感器、計算機(jī)在線控制的自動發(fā)酵微生物培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展一、表面培養(yǎng)實驗室進(jìn)行表面培養(yǎng)常采用試管、扁瓶和培養(yǎng)皿。淺盤培養(yǎng)表面培養(yǎng)法，操作簡便，設(shè)備簡單，常用于實驗室小規(guī)模培養(yǎng)。但也存在一些缺點：（1）用于大規(guī)模生產(chǎn)的潛力很??；（2）不便于對體系進(jìn)行監(jiān)測控制；（3）不易于保持系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境條件的均一。二、深層培養(yǎng)厚層通風(fēng)培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)搖瓶大型發(fā)酵罐用于Hungate滾管技術(shù)中的厭氧試管剖面圖厭氧手套箱fermenter生長曲線：將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，定時取樣，測菌量。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌增長數(shù)目的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制所得的曲線。（一）遲緩期（lagphase）1.現(xiàn)象：活菌數(shù)沒增加，曲線平

行于橫軸。2.原因：由于細(xì)胞進(jìn)入新環(huán)境,

細(xì)胞數(shù)目無增長，甚至有所下

降有一個適應(yīng)過程，進(jìn)行大量

的酶（誘導(dǎo)酶）的生成。3.細(xì)胞特點:細(xì)胞的新陳代謝非

常旺盛，個體體積顯著增大，

為細(xì)胞分裂作準(zhǔn)備。4.此期長短：與菌種遺傳特性、菌齡、接種量、培

養(yǎng)條件有關(guān)。5.意義：在實際工作中，縮短lagphase的措施：

1）加大接種量（群體優(yōu)勢----適應(yīng)性增強(qiáng)）

2）先用對數(shù)其的種子（此時細(xì)胞分裂旺盛）

3）調(diào)整培養(yǎng)基的成分，使種子基含有發(fā)酵培養(yǎng)基的成分

4）選用繁殖快的菌種（二）對數(shù)期(logphase)1.現(xiàn)象：細(xì)胞數(shù)目以幾何級

數(shù)增加，其對數(shù)與時間

呈直線關(guān)系。2.細(xì)胞特點：此時細(xì)胞的

大小、組成、生理特征等

均趨于一致，代謝活躍，

生長速率高，代時穩(wěn)定。２．代時（世代時間Ｇenerationtime,G）：單個細(xì)胞完成一次分裂所需要的時間３．意義：（１）代謝、生理研究的好材料

（２）生產(chǎn)中用其作種G=t/n=t1—t03.3(lgx—lgx0)（１）Ｇ與菌種有關(guān)；（２）受培養(yǎng)條件(溫度、營養(yǎng)成分）的制約；同一菌種在不同培養(yǎng)條件下代時不同(三)穩(wěn)定期（stationaryphase):2.

特點:細(xì)胞的菌體形態(tài)典型，

芽孢形成，細(xì)胞內(nèi)開始

貯藏物質(zhì)。1.現(xiàn)象：活菌數(shù)目不增不

減，生長速率趨于0,曲

線有一下降的趨勢。3.出現(xiàn)原因：4.意義：1）營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗；2）有毒代謝產(chǎn)物大量積累；

3）外界條件影響（pH、高細(xì)胞濃度，氧化還原電位等）1）發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時期（抗生素、氨基酸等），生產(chǎn)上應(yīng)盡量延長此期，提高產(chǎn)量，措施如下：補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）調(diào)pH

調(diào)整溫度2）穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達(dá)到最高。3）產(chǎn)量常數(shù)：概念：表示微生物對基質(zhì)利用效率的高低

Y=菌體干重/消耗營養(yǎng)物質(zhì)的濃度

根據(jù)產(chǎn)量常數(shù)可確定微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需要量如：Y=0.5，表示要得到5g菌體，需某營養(yǎng)物（葡萄糖）10g。（四）衰亡期1.現(xiàn)象：細(xì)胞死亡速率>生長

速率。一般總菌數(shù)不變,活菌

數(shù)曲線下降。2.特點：菌體變形，大小

不一，細(xì)胞出現(xiàn)自溶,生理代

謝活動停滯。三、連續(xù)培養(yǎng)恒濁法恒化法（一）恒濁培養(yǎng)概念：在恒濁器內(nèi)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使細(xì)菌培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。原理：維持菌濃度不變。特點：基質(zhì)過量，菌以最高速率生長；但工藝復(fù)雜，煩瑣。（二）恒化培養(yǎng)概念：以恒定流速使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細(xì)菌生長速率恒定的方法。原理：恒化器中動態(tài)平衡的穩(wěn)定性，是以某種生長限制因子（如碳、氮源；生長因子；無機(jī)鹽等）的濃度來控制菌的生長速度。特點：維持營養(yǎng)成分的低濃度，控制微生物生長速率。連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點1、縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備的利用率；2、便于自控。降低動力消耗及勞動強(qiáng)度；3、產(chǎn)品均一；連續(xù)培養(yǎng)的主要問題：（1）隨著操作時間的增加，染菌的機(jī)率增大。如提高培養(yǎng)溫度、改變pH或原料等，可使雜菌不易生長。

(2)連續(xù)培養(yǎng)的另一個問題是在長期的培養(yǎng)中，菌種發(fā)生變異，引起生產(chǎn)能力下降。

固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)

細(xì)胞固定化是通過包埋法、微膠囊法、吸附法等將細(xì)胞固定在載體的內(nèi)部或表面，加入營養(yǎng)液及合適的培養(yǎng)條件，得到代謝產(chǎn)物。

優(yōu)點：可提供高密度的細(xì)胞；減少細(xì)胞的流失，反復(fù)利用；簡化細(xì)胞與代謝產(chǎn)物的分離工藝。

缺點：成本高；易污染；物質(zhì)傳遞阻力大；只能用于細(xì)胞分泌型產(chǎn)物的發(fā)酵。四、同步生長：同步培養(yǎng)法：能獲得處于同一生長階段

的群體細(xì)胞的培養(yǎng)方法同步生長：運(yùn)用同步培養(yǎng)技術(shù)，控制微

生物生長，使之處于同一生長

階段并同時分裂。獲得同步生長的方法：1.機(jī)械法—收集同樣大小的細(xì)胞密度梯度離心：選擇性濾膜法:2.調(diào)整生理條件法：

溫度、光、限制因子等

例：溫度開始很低，使其均處在

僅活著的狀態(tài)——升高溫度——

同步生長３.抑制ＤＮＡ生長法：

加入代謝抑制劑，阻遏DNA

復(fù)制——解阻遏——同步五、中間補(bǔ)料培養(yǎng)（1）有利于消除或減少因易被利用基質(zhì)（如葡萄糖）引起的抑制作用的影響。（2）使培養(yǎng)過程中的需氧量能適應(yīng)培養(yǎng)設(shè)備的供氧能力。（3）避免培養(yǎng)基中的有毒組分（如青霉素發(fā)酵中作為前體的苯乙酸）對培養(yǎng)的影響。（4）中間補(bǔ)料可為實現(xiàn)高密度培養(yǎng)創(chuàng)造條件。六、混合培養(yǎng)七、高密度培養(yǎng)指微生物在液體培養(yǎng)基中細(xì)胞群體密度超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上時的生長狀態(tài)或培養(yǎng)技術(shù)?，F(xiàn)代高密度培養(yǎng)技術(shù)主要是用于基因工程菌生產(chǎn)多肽類藥物。選取最佳培養(yǎng)基成分和各成分含量補(bǔ)料提高溶解氧的濃度防止有害代謝產(chǎn)物的生成第二部分：有害微生物的控制1、滅菌滅菌采用任何強(qiáng)烈理化因素使物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失生長繁殖能力的措施殺菌Bacteriocidation

菌體雖死，形體尚存溶菌Bacteriolysis

菌體被殺死以后，細(xì)胞自溶、裂解而消失2、消毒概念：采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分的病原菌，而對被消毒的對象基本無害實例皮膚、水果和飲用水藥劑消毒巴氏消毒法3、防腐概念：

采用某種理化因素完全抑制微生物的生長繁殖（制菌作用）防腐方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用低溫：4攝氏度以下缺氧：抽真空、充氮或二氧化碳、除氧劑干燥：曬干、烘干或紅外線干燥高滲：鹽腌高酸度：泡菜發(fā)酵高醇度防腐劑：苯甲酸、對羥基甲酸甲脂等4、化療化學(xué)治療指具有高度選擇力（對病原菌具高度選擇力而對其宿主基本無毒）的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)的病原微生物的生長繁殖，達(dá)到治療宿主疾病的目的的一種措施?；瘜W(xué)治療劑磺胺藥物、抗生素、生物藥物素、中草藥有效成分幾種常用的理化滅菌方法干熱滅菌法:火焰燒灼法、烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法濕熱滅菌/消毒法常壓法巴氏消毒法煮沸消毒法：100下煮沸幾分鐘，飲用水消毒間歇滅菌法加壓法常規(guī)加壓蒸汽滅菌法連續(xù)加壓蒸汽滅菌法高溫滅菌1、干熱滅菌法電熱烘箱，150-170攝氏度1-2小時干熱滅菌機(jī)理：細(xì)胞膜破壞、蛋白質(zhì)變性和原生質(zhì)干燥。灼燒

接種針/環(huán)、病原菌材料、動物尸體燒毀2、濕熱滅菌法100度以上的加壓蒸汽進(jìn)行滅菌濕熱溫度對微生物的作用細(xì)菌與真菌營養(yǎng)細(xì)胞：~60度處理5~10min酵母菌細(xì)胞和霉菌孢子：~80度細(xì)菌芽孢：~120度15min濕熱滅菌條件是怎么確定的？發(fā)明人：巴斯德殺死不耐熱的病原菌巴氏消毒的兩種類型低溫維持法LTH：65度-30min高溫瞬時法HTST：72度-15sec2.1巴氏消毒法2.2間歇滅菌法分段滅菌適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌操作程序保溫蒸煮：80-100度15-60min保溫過夜：室溫或37度如此重復(fù)三次3、利用溫度殺菌的定量指標(biāo)熱死時間熱死溫度4、影響蒸汽加壓滅菌效果的因素滅菌物體含菌量滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度滅菌對象的pH滅菌對象的體積加熱與散熱速度5、高溫對培養(yǎng)基成分的有害影響及防治有害影響沉淀有機(jī)物（多肽類）、無機(jī)物（磷酸鹽、碳酸鹽）營養(yǎng)破壞Maillard

反應(yīng)、毒性pH值改變培養(yǎng)基濃度降低防止法特殊加熱滅菌法分別單獨滅菌低壓滅菌過濾除菌法：各種濾器缺點：無法去除病毒其他方法6、過濾除菌法：不能用加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維生素、血清），一般可用細(xì)菌過濾器進(jìn)行除菌。7、紫外線滅菌法：