第6章 凝膠過濾

第六章凝膠過濾GelFiltration概述凝膠過濾又稱分子篩或稱體積排阻層析。根據(jù)溶質(zhì)分子量的大小而分離的一種液相層析技術(shù)。其特點(diǎn)是:（1）填料是具有一定范圍的篩孔尺寸的凝膠，被分離物按分子量的差異在流動(dòng)相的推動(dòng)下,大分子被凝膠的篩孔排阻而先流出層析柱，小分子在孔中擴(kuò)散而后流出。（2）被分離物不與填料發(fā)生任何化學(xué)結(jié)合；降低了因不可逆結(jié)合而引起的蛋白質(zhì)的損失和失活。（3）快速純化生物大分子，并在第一洗脫峰中，雜質(zhì)流于柱中。凝膠過濾的發(fā)展理論與技術(shù)的發(fā)展1951.Kosikowrky用淀粉柱子分離蛋白質(zhì)中的氨基酸；1955.Lundyuist，Storgaras在淀粉柱上按組分的分子量大小分離，提出排阻層析的概念；1956.Puthven在淀粉柱上估計(jì)了分子量。載體材料的發(fā)展1959.Rovath,Flodin合成了葡聚糖（Sephadex）凝膠；1962.Hierten,Mosbach合成聚丙烯酰胺凝膠（Polyacrylamidebiogels）;1964.Hierten合成瓊脂糖球形凝膠（Spheriealagarose）1976.Regnier合成甘油丙基多孔玻璃（Glycerlpropyl）內(nèi)容提要第一節(jié) 凝膠的分類及其性質(zhì)第二節(jié) 基本原理第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用第一節(jié)凝膠的分類及其性質(zhì)所用的填料或載體通稱凝膠；凝膠過濾層析中的填料產(chǎn)品較多，為了分辨純化效果及分離樣品的活性保存，對(duì)填料（載體或介質(zhì)）的選擇、層析條件的確定是首要考慮因素。凝膠篩孔的尺寸大小、凝膠顆粒的大小、均勻性、機(jī)械強(qiáng)度及化學(xué)穩(wěn)定性均是凝膠層析的基本性質(zhì)。

凝膠層析中常用凝膠包括5個(gè)主要類型，即：葡聚糖凝膠(dextrangel商品名Sephadex)瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharosegel)聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel，商品名為Bio—GelP)Sephacryl由瓊脂糖及葡聚糖組成的復(fù)合凝膠(商品名為Superdex）一、葡聚糖凝膠SephadexG-型性質(zhì)：1.親水性：在水中易膨脹；2.交聯(lián)度的型號(hào)豐富適應(yīng)各種分子量范圍的分級(jí)分離；3.穩(wěn)定性：對(duì)強(qiáng)酸、氧化劑敏感。4.吸附性：凝膠含少量的羧基基團(tuán)能與堿性蛋白質(zhì)的電荷基團(tuán)發(fā)生吸附，在純化及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)有影響；可用中性鹽0.05MNaCl洗脫克服。

結(jié)構(gòu)：右旋糖酐G型與交聯(lián)劑3－氯－1,2－環(huán)氧丙烷以醚鍵交聯(lián)而成。二、瓊脂糖凝膠SepharoseSepharose6B,4B,2B;由D-半乳糖和3，6脫水的L-半乳糖合成的球形結(jié)構(gòu)。其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由糖鏈間的次級(jí)氫鍵起穩(wěn)定作用。由瓊脂糖的濃度控制網(wǎng)孔的疏密和大小。分離范圍1×104－5×107。ScanningelectronmicrographofanagarosegelMagnificationx50,000Ref: AndersS.Medin,PhDThesis,UppsalaUniversity1995SepharoseCL(瓊脂糖凝膠)Sepharose與2、3－二溴丙醇反應(yīng)形成交聯(lián)瓊脂糖。（SepharoseCL）其化學(xué)、物理的穩(wěn)定性提高；機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)；適用pH范圍更寬。分離范圍1×104－5×107。Bio-Gel A 三、聚丙烯酰胺凝膠Bio－GelP

丙烯酰胺用甲撐雙丙烯酰胺交聯(lián)成球形的聚丙烯酰胺的親水性干凝膠。特性:對(duì)酸、堿的穩(wěn)定性較弱，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿引起酰胺基脫水。工作的pH范圍2－10，在有SDS、鹽酸胍、尿素、20％乙醇溶液中可安全使用。分離蛋白質(zhì)分子量范圍800-1.5×105。根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠的溶脹性質(zhì)和分離范圍的不同，可分成10種類型。各種類型均以英文字母P和阿拉伯?dāng)?shù)字表示，從Bio-GelP-2至Bio-GelP-300。P后面的阿拉伯?dāng)?shù)字乘以1000即相當(dāng)于排阻限度(按球蛋白和肽計(jì)算)。四、聚丙烯酰胺葡聚糖Sephacryl烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺共價(jià)交聯(lián)成。其物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，工作的pH范圍2－11；可用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖、蛋白聚糖的分離。分離范圍1000－1×107。五、Superdex高交聯(lián)度的瓊脂糖與葡聚糖共價(jià)結(jié)合的分子篩。具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)；廣泛的pH工作范圍；對(duì)SDS、尿素、鹽酸胍等不敏感；并不影響分離效果。既具有瓊脂糖凝膠的特性；又具有葡聚糖凝膠的特性，是Pharmacia公司推出的新一代凝膠產(chǎn)品，適合于精細(xì)層析分離。目前分辨率、選擇性最高的凝膠過濾介質(zhì)，流速快而反壓低。Superdex30<10,000Superdex753000-70,000Superdex20010,000-600,000內(nèi)容提要第一節(jié) 凝膠的分類及其性質(zhì)第二節(jié) 基本原理第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用第二節(jié)基本原理基質(zhì)具有立體網(wǎng)狀篩孔結(jié)構(gòu)。依據(jù)交聯(lián)度不同，孔徑的大小按不同的型號(hào)區(qū)分，而對(duì)某一種基質(zhì)其孔徑一致；當(dāng)分離物足夠大而完全排阻，不進(jìn)入凝膠，隨著外水體積（Vo）洗脫流出；或完全不排阻，洗脫時(shí)在凝膠的篩孔中自由滲透、擴(kuò)散；物質(zhì)在凝膠柱層析中被排阻的范圍在0～100％之間的為部分排阻或不完全排阻。床體積Vt、內(nèi)水體積Vi、外水體積Vo

與分配系數(shù)Kav之間的關(guān)系任何一種分離物在凝膠層析柱中被排阻的范圍在0～100％之間，用排阻系數(shù)Kav表示。Kav的大小依賴凝膠床體積Vt，外水體積Vo及分離物本身的洗脫體積Ve。見公式：Vt=Vo+Vi+Vg當(dāng)Vt、Vo確定后，Ve是隨著分離物的分子質(zhì)量的變化而變化，分子量愈大，Kav值愈?。环粗嗳?。依據(jù)公式Kav值在0～1之間變化Kav=Ve-VoVt-VoVt與Vo是定值，Ve隨被分離的分子量變化而變化。Ve-VoVi+VgVt=Vo+Vi+VgVg忽略時(shí),Kav＝Vt=Vo+Vi或Vt-Vo=ViVe-VoVi=KavVe=Vo;Kav=0.Ve=Vo+Vi=VtKav=1,

當(dāng)0﹤Kav﹤1：Ve=Vo+Kav*Vi,表示內(nèi)水體積只有一部分可被組分利用擴(kuò)散，其Ve在Vo與Vo+Vi之間變化。Kav﹥1,凝膠有吸附作用，Ve﹥Vo+Vi。帶入上式，有Kav可以有下列幾種情況：(1)當(dāng)Kav=O時(shí)，則Ve=Vo，即對(duì)于根本不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部的大分子物質(zhì)(全排阻)，洗脫容積等于空隙容積(組分I)。(2)當(dāng)Kav=1時(shí)，Ve=Vo+Vi，即小分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時(shí)，洗脫容積應(yīng)為空隙容積與內(nèi)容積之和(組分Ⅲ)。(3)當(dāng)0<Kav<1時(shí)，Ve=Vo+Kav*Vi。表示內(nèi)容積只有一部分可被組分利用，擴(kuò)散滲入，Ve即在Vo與Vo+Vi之間變化(組分Ⅱ)。(4)有時(shí)Kav>1，表示凝膠對(duì)組分有吸附作用，此時(shí)Ve>Vo+Vi，例如一些芳香族化合物的洗脫容積遠(yuǎn)超出理論計(jì)算的最大值，這些化合物的Kav>1，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在SephadexG一25中的Kav值分別為1.2，1.4和2.2。

層析柱中各物質(zhì)發(fā)生連續(xù)地排阻與擴(kuò)散效應(yīng)，結(jié)果是：大分子量物質(zhì)首先出來，再依分子量大小次序隨后洗脫出。因此，Kav值的差異影響分離效果，Kav值的差異性大，分離效果好，Kav值的差異性小，分離效果差。不同上樣體積時(shí)洗脫體積的測(cè)定A：加樣體積極小時(shí)，洗脫體積Ve從樣品入柱開始－洗脫峰的最大處止。B:加樣體積中量時(shí)，洗脫體積Ve從樣品入柱1/2時(shí)－洗脫峰的最大處止。C：加樣體積特大時(shí)，洗脫體積Ve從樣品入柱開始－洗脫峰出現(xiàn)止。VeVeVe原理小節(jié)Kav=0Ve=Vo

完全排阻Kav=1Ve=Vt

完全不排阻Kav=0~1之間

部分排阻Kav﹥1Ve﹥Vt

吸附現(xiàn)象

用凝膠過濾層析，溶質(zhì)和凝膠表面之間沒有任何相互作用時(shí)，體積排阻層析才能嚴(yán)格按照分子量大小進(jìn)行分離；特殊分離效果與分子的結(jié)構(gòu)、形狀密切相關(guān)。

例：SephadexG－50分離范圍＝1500～30000，表示小于1500時(shí)，Kav=1；大于或等于30000時(shí)，Kav＝0；當(dāng)M.W＝20000時(shí)，方法：1）測(cè)量洗脫體積；2）經(jīng)過計(jì)算得出Kav＝0.67，故可以將上述三者分開。問M.W為5萬(wàn)和7萬(wàn)的蛋白質(zhì)，可否分開？為什么？?jī)?nèi)容提要第一節(jié) 凝膠的分類及其性質(zhì)第二節(jié) 基本原理第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用第三節(jié)操作一、凝膠的選擇與處理凝膠的選擇；凝膠的處理；凝膠用量的計(jì)算型號(hào)選擇粒度克＝

Лrh膨脹度（床體積／克干重）21.漂去破、碎的凝膠；2.凝膠的充分溶脹，沸水浴或真空泵抽氣。凝膠顆粒大小對(duì)分辨率的影響

分辨率：粗顆粒劣于細(xì)顆粒；更劣于超細(xì)顆粒。核苷酸在不同大小凝膠顆粒中的洗脫圖譜

二、凝膠柱的制備柱子的選擇；柱子的填裝；柱子的鑒定平衡柱子直徑與長(zhǎng)度比例、流速與分辨率的關(guān)系加樣量與洗脫峰及分辨率的關(guān)系三、加樣與洗脫加樣洗脫加樣量的控制原則定性目的：依據(jù)檢測(cè)器的靈敏度確定，紫外檢測(cè)蛋白質(zhì)，加樣量為Vt的1％～5％。（凝膠過濾會(huì)將樣品稀釋2～3倍），須對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐饪s。制備與脫鹽：在不影響分辨率時(shí)，盡量加大樣品體積，可達(dá)床體積的20～30％；加樣量根據(jù)分配系數(shù)Kav或洗脫體積Ve確定。ABVeAVeBA、B兩洗脫物體積之差為分離體積Vs，Vs=VeA-VeB，當(dāng)樣品體積Vp≤Vs時(shí)，二者分開。所以Vs,Vp，便可分開。樣品粘度與洗脫曲線、分辨率的關(guān)系洗脫與繪制洗脫曲線洗脫液的組成簡(jiǎn)單：主要是洗脫液能溶解被洗脫物并不使其變性或失活。一般選用單一的緩沖液，若無(wú)非特異性吸附，離子強(qiáng)度為0.05M的中性鹽；或用蒸餾水洗脫。洗脫流速恒定：用操作壓、恒流泵及限制閥進(jìn)行調(diào)節(jié)；或用恒壓瓶、調(diào)節(jié)層析柱的進(jìn)口與出口的兩液面高度，使水壓恒定，均勻，利于Kav值穩(wěn)定，提高分離效果。安全裝柱的注意保證柱子不會(huì)脫水保持水壓高度一致，柱壓穩(wěn)定裝柱子的操作圖示凝膠的處理凝膠的填裝柱子型號(hào)的選擇層析系統(tǒng)的接通與平衡柱子的檢測(cè)與樣品的加入四、凝膠柱的保養(yǎng)和凝膠的保存

交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，適宜于微生物的生長(zhǎng)。因此染菌后的凝膠會(huì)改變層析特性，影響效果。(1)經(jīng)常使用的凝膠以濕態(tài)保存為宜。濕態(tài)保存常用的抑菌劑有0.02％疊氮鈉、0.002％洗必太、0.1mol／L氫氧化鈉等。(2)較長(zhǎng)時(shí)期不使用的凝膠可采用干燥保存法。內(nèi)容提要第一節(jié) 凝膠的分類及其性質(zhì)第二節(jié) 基本原理第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用第四節(jié)應(yīng)用一、脫鹽和濃縮二、分離生物大分子物質(zhì)三、去熱源物質(zhì)四、測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量一、脫鹽與濃縮利用鹽類小分子物質(zhì)可以在凝膠的篩孔中自由擴(kuò)散，而大分子物質(zhì)被排阻在其外的原理，選擇凝膠SephadexG-25（700－8000）將小分子鹽有效地除去。比透析方法更加溫和，速度快，不引起生物大分子的變性。對(duì)鹽析樣品的后處理非常適用。凝膠具有吸水的性質(zhì)，可將透析袋內(nèi)的稀樣品進(jìn)行濃縮。蛋白質(zhì)的脫鹽和濃縮二、分離生物樣品某些理化性質(zhì)相近（溶解度、電荷性），分子量不同，或聚合體不等的混合樣品，其他方法難以奏效時(shí)，凝膠過濾方法便適用。用加工修飾的凝膠純化糖鏈分子、膜蛋白、抗原、抗體、分離重組蛋白，包涵體蛋白、肽類、核酸、病毒以及寡核苷酸等。分離病毒：

根據(jù)顆粒的大小將不同的病毒分別洗脫＞30nm＞20nm三、去除熱源（內(nèi)毒素）物質(zhì)熱源又稱內(nèi)毒素，是含脂肪A、糖類和蛋白，帶負(fù)電荷的復(fù)合大分子。由于是制備藥品工藝中難以克服的問題，經(jīng)常引起臨床的安全?？衫媚z排阻原理，將熱源物質(zhì)從藥品中排除。四、用凝膠過濾方法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量根據(jù)凝膠層析的原理，對(duì)同一類型物質(zhì)的洗脫特征與組分的分子量有關(guān)。流過凝膠柱時(shí)，按分子大小順序流出，分子量大的走在前面。洗脫體積Ve是該物質(zhì)分子量對(duì)數(shù)的線性函數(shù)，可用下式表示：Kav=-blgMr+c式中，b與c為常數(shù)，Mr為分子量。通常多以Kav對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖得一曲線，稱為“選擇曲線”，曲線的斜率說明凝膠性質(zhì)的一個(gè)很重要的特征。

依據(jù)球形蛋白質(zhì)分子的大小、洗脫體積、速率的差異將各自分開，以標(biāo)準(zhǔn)分子制作的洗脫曲線，以其Ve及Kav值判斷測(cè)定樣品的分子量。圖示12400－67000的幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的㏒M、Kav的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

0.20.40.60.8KavLogM4.84.