Chapter 1緒論 and 2細胞破碎

生物分離工程

主講：張媛媛MPmail:zyy800928@本課程教材及參考書目孫彥第二版嚴希康俞俊棠本課程的主要內容1緒論2細胞分離與破碎3初級分離4膜分離5萃取6吸附分離技術和理論7液相色譜8親和色譜9電泳和電色譜第一章緒論第一節(jié)生物技術與生物分離

生物技術（biotechnology)

有機體的操作和應用有機體生產有用物質、改善人類生存環(huán)境的技術

生物技術的主要目標：生物物質的高效生產生物加工過程（Bioprocess）？_____生物產物的生產過程生物加工過程上游技術：優(yōu)良生物物種選育,基因工程，細胞工程和生物反應（酶反應、微生物發(fā)酵、動植物細胞培養(yǎng)等）下游技術DownstreamProcessing

目標產物的分離純化（目標產物的提取、濃縮、純化及成品化）生物分離的基本概念

從生物材料、微生物的發(fā)酵液、生物反應液或動植物細胞的培養(yǎng)液中分離并純化有關產品（如具有藥理活性作用的蛋白質等）的過程，稱為生物分離，又稱下游加工過程。

生物分離（bioseparation)是生物技術的重要組成部分。生物下游加工在生物技術中的地位生物產品的特殊性、復雜性、和嚴格的質量要求，導致下游加工過程的成本一般占整個生物加工過程成本的大部分。

例如：一般酶：占70％藥用酶：高達85％基因工程表達產物：85％-90％以上。

第二節(jié)生物物質和生物分離生物物質種類（按分子量大小分類）

小分子（Mass<1000D）：抗生素、有機酸、多肽類、脂類、氨基酸等

生物大分子（Mass>1000D）：酶、抗原、抗體、多肽、蛋白質類

超大分子（Mass106-107）：病毒、質粒DNA等

細胞及生物體組織：疫苗、菌苗、胎盤組織液生物物質種類（按發(fā)酵時目的產物所在的位置分類）

cell內產物：胰島素、白細胞介素、干擾素、重組蛋白質（大腸桿菌表達）、胞內酶

cell外產物：抗生素（青霉素、紅霉素）、胞外酶（α-淀粉酶）、重組蛋白（酵母菌、動物細胞表達）等

常見的生物產品氨基酸、酶類、多肽、蛋白質、核酸、多糖、脂類、有機酸等生物物質的用途

生物藥物、功能食品和添加劑、飼料、化妝品、精細生化產品、大宗生化產品、生物能源生物分離工程研究的重點生物產品的特點（1）目標產物穩(wěn)定性差，易導致生物活性的降低甚至喪失（a

pH

,溫度;b酶作用，染菌）（2）生物材料組成復雜，目標產物與其類似物常法難分離（3）原料液中目標產物的濃度一般都很低，雜質含量卻很高（4）對目標產物的質量要求高（藥品）原料液細胞分離(離心，過濾)細胞－胞內產物路線一路線二細胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產物粗分離(沉淀分級、萃取、膜分離等純化(色譜、電泳、電色譜)脫鹽(凝膠過濾、超濾、離子交換濃縮(超濾)精制(結晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復性生物分離過程的一般流程：發(fā)酵法生產L-異亮氨酸工藝路線

（1）活性：須設計合理的分離過程和操作條件，實現目標產物的快速分離純化，獲得高活性目標產品；

（2）安全性：須除去有害人類健康的物質（如熱原及具有免疫原性的異體蛋白等）并防止其從外界混入；

（3）純度：須優(yōu)化設計分離過程和各分離操作，采用高效分離純化技術，以除去難分離雜質（包括目標產物類似物及其異構體）；

（4）濃度：需對原料液進行高度濃縮，以致下游加工過程的成本顯著增大。第三節(jié)生物分離過程的特點

第四節(jié)生物分離技術和原理溶質分離的本質：有效識別混合物中不同溶質間物理、化學和生物學性質的差別，利用能夠識別這些差別的分離介質和（或）擴大這些差別的分離設備實現溶質間的分離或目標組分的純化。物質的性質包括以下幾個方面：物理學性質1)力學性質：密度、大小、形狀（重力沉降、離心、過濾、膜分離）2)熱力學性質：溶解度、揮發(fā)度、表面活性、相間分配平衡（萃取、結晶、沉淀、泡沫分離、吸附和離子交換）3）傳質性質：粘度、分子擴散和熱擴散（應用少）4）電磁性質：荷電性質、電荷分布、等電點、磁性（電泳、電滲析、離子交換、電色譜）化學性質

利用化學反應進行分離（化學吸附和化學吸收）生物學性質（生物分離特有的）生物分子間的分子識別作用、立體選擇性（親和色譜、手性分子的修飾）生物分離技術的分類平衡分離差速分離分離操作平衡分離（擴散分離）差速分離原理：利用外力驅動溶質遷移產生的速度差異傳質推動力：有壓力差、重力、離心力、電位梯度和磁場梯度等；分離方法：超濾、反滲透、電滲析、電泳、機械分離法（過濾、重力沉降和離心沉降）原理：溶質在兩相（氣液、氣固、液液、液固）間分配平衡的差異傳質推動力：溶質偏離平衡態(tài)的濃度差方法：萃取、結晶（沉淀）、吸附和離子交換等生物分離操作的策略1)需利用基于不同原理的多步分離操作的串聯(lián)或組合2)平衡分離技術（萃取、沉淀等）多采用多級分離操作提高分離效率。（差速分離如膜分離亦可）3)需根據目標產物性質和共存雜質的性質選擇最佳分離方法（高純度、高收率、低成本）第五節(jié)

生物分離效率分離效率可從兩個方面來評價：分離方法和設備分離過程和產品對分離方法和設備的評價指標（針對特定分離方法或設備：離心、膜分離、萃取、色譜）分離容量（capacity)單位體積的分離設備（或分離介質）處理料液或目標產物的體積或質量分離速度(speed)單批次分離所需時間，或連續(xù)分離過程的進料速度，批次時間越短，分離速度越快分辨率(resolution)目標產品的純化效果或雜質的去除能力具體要求：高容量、高速度、高分辨率對分離過程和產品的評價指標濃縮程度分離純化程度回收率濃縮程度用濃縮率（m）表達，是評價以濃縮為目的的分離過程的最重要指標CTP產品中目標產物的濃度CTC原料中目標產物的濃度X表示雜質T表示目標產物意義：1）如mT>1，則目標產物得到富積；2）如mT=mX，則目標產物未得到分離純化。分離純化程度用分離因子（seperationfactor)

表達,又稱分離系數。適用于蒸餾、萃取等平衡分離過程適用于連續(xù)穩(wěn)態(tài)分離對于具有生物活性的蛋白質或酶，常常用分離純化前后目標產物的比活A[U/mg]之比表示目標產物的分離純化程度，意義：A、目標產物濃度，雜質濃度，則分離因子大，分離效率；B、=1時，則目標產物未得到分離純化回收率：目標產物回收的比例連續(xù)操作間歇操作生物分離工程研究的根本任務1）分離方法、分離介質和設備2）設計和優(yōu)化分離過程，提高分離效率，減少分離步驟，縮短分離時間，實現高純度，高收率，低成本的分離目標第二章細胞分離與破碎一、重力沉降球形粒子的Stokes沉降速度（流體流動處于滯留區(qū)）其中：Re為雷諾準數；為阻力系數；d為顆粒粒徑；L為液體粘度；s和L分別表示顆粒密度和液體密度。第一節(jié)細胞分離（2.6）菌體細胞重力沉降速度符合式（2.6）單一粒子的沉降速度顆粒濃度較大時的沉降速度（2.6）（2.6a）菌體和動植物細胞的重力沉降特點：菌體細胞體積小，沉降速度慢。提高沉降速度的方法：凝聚：加入中性鹽（降低菌體表面雙電層排斥電位，使菌體凝聚）絮凝：加入高分子絮凝劑：如聚丙烯酰胺或聚乙烯亞胺（使菌體間產生架橋作用，形成較大凝聚顆粒）發(fā)酵液預處理的方法（補充）凝聚技術：指在電解質作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現象

常用凝聚劑：Al2(SO4)3.18H2O(明礬)，AlCl3.6H2O，FeCl3，ZnSO4，MgCO3絮凝技術：指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團的過程。

常用絮凝劑：

a.聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）b.苯乙烯類衍生物及其無機高分子聚合物絮凝劑c.天然有機高分子絮凝劑(明膠、海藻酸鈉、甲殼素、右旋糖苷)實驗室和工業(yè)生產中最廣泛應用的非均相分離手段適用于菌體和細胞的回收或除去用于血球、胞內細胞器、病毒以及蛋白質的分離也廣泛用于液液相分離二、離心沉降離心沉降速度其中：r為離心半徑；為旋轉角速度；N為離心機轉數；Zg離心加速度；S為沉降系數，是溶劑物性的函數。離心分離法差速離心分級（Differentialcentrifugation)定義：采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。主要用于分離沉降系數差異較大的顆粒。應用：生化工業(yè)中常用的離心方法，可用于收集或除去菌體細胞、沉淀的分離關鍵參數：離心機轉數和時間區(qū)帶離心（Zonalcentrifugation)定義：在離心前于離心管內先裝入密度梯度介質（如蔗糖溶液等），樣品加于密度梯度之上，在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同區(qū)帶的分離方法主要用于分離沉降系數較接近的物質也稱為密度梯度離心可用于蛋白質、核酸等生物大分子的分離純化，但處理量小，一般僅限于實驗室水平

根據分離原理，區(qū)帶離心分為：差速區(qū)帶離心和平衡區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心：介質密度梯度中的最大密度小于待分離目標產物的密度，離心操作中，料液中的各個組份在密度梯度中以不同的速度沉降，根據各組份沉降系數的差別，形成各自的區(qū)帶。密度梯度介質：蔗糖，CsCl（核酸的分離）和NaBr（脂蛋白的分離）等。平衡區(qū)帶離心（等密度梯度離心）：介質的密度梯度包含待分離樣品中所有組分的密度，離心過程中各組分將逐步移至與其自身密度相等的溶劑密度處形成穩(wěn)定的區(qū)帶。

差速區(qū)帶離心與平衡區(qū)帶離心的區(qū)別

1、依據的原理不同差速區(qū)帶離心依據各組分沉降速率差異被分離；平衡區(qū)帶離心依據組分本身的密度差異被分離。2、介質的密度梯度范圍不同差速區(qū)帶離心介質的最大密度小于樣品中目標產物的密度；平衡區(qū)帶離心介質密度包含樣品各組分的密度。3、時間效應不同差速區(qū)帶離心不能長時間離心；平衡區(qū)帶離心長時間離心將各組分停留在等密度位置形成穩(wěn)定區(qū)帶。離心分離設備分類據操作是否連續(xù)可分為：間歇式、連續(xù)式根據形式可分為：立式、臥式根據操作溫度可分為：常溫離心、冷凍離心機等根據離心力的大小可分為：低速（<8000rpm)、高速（1-2.5萬rpm）和超速離心機（2.5萬-12萬rpm）。

根據適用范圍：實驗室用離心機（離心管式轉子離心機）和工業(yè)離心機（管式和碟片式離心機）大容量冷凍離心機臺式離心機高速冷凍離心機超速冷凍離心機離心機的種類和適用范圍項目低速高速超離轉速(×103rpm)2-610-2630-120離心力(×103g)2-78-80100-600適用范圍細胞適用適用適用細胞核適用適用適用細胞器－適用適用蛋白質－－適用工業(yè)離心設備管式離心機（tubularbowlcentrifuge)碟片式離心機(disc-typebowlcentrifuge)管式離心機（圓筒式離心機）優(yōu)點：轉速可達2萬r/min以上，離心力較大.可間歇操作，也可連續(xù)操作缺點：沉降面積小，處理能力較低管式離心機的處理能力為：其中：稱為離心沉降面積，是離心機結構和操作條件的函數；

L為管長；r2為轉筒內徑。碟片式離心機(分離板式離心機)特點：結構復雜，離心轉速一般較管式離心機低，約1萬r/min。碟片的作用是縮短固體顆粒（或液滴）的沉降距離、擴大轉鼓的沉降面積，提高處理能力。三、過濾（filtration)定義：利用多孔介質（如濾布）截留固液懸浮液中的固體粒子，進行固液分離的方法。過濾速度濾液的透過阻力來自兩個方面：（1）過濾介質（2）濾餅濾餅阻力是主要因素過濾操作以壓力差為透過推動力其中：A為過濾面積；p為操作壓力；Q為濾液體積；L為濾液粘度；Rm和Rc分別為介質和濾餅的阻力；濾液的透過速度：濾餅阻力是影響過濾操作的主要因素為濾餅的平均比阻；W為濾餅干重。不可壓縮性濾餅：為常數；可壓縮性濾餅：＝kpmm為可壓縮性濾餅的壓縮指數；助濾劑可使m減小濾餅阻力濾餅的特性微生物助濾劑（v/v,%)m面包酵母大腸桿菌0105000.450.340.280.79乳膠粒子00壓力

濾餅的平均比阻＝kpm過濾操作中非常敏感和重要的操作參數，特別是可壓縮性強（m值大）的濾餅，一般需緩慢增大操作壓力，最終壓力不超過0.3-0.4MPa減小濾餅阻力的措施

在過濾操作前，須對料液作以下處理：1）絮凝(高分子聚電解質：聚丙烯酰胺類和聚乙烯亞胺）或凝聚劑（鋁、鐵的鹽類或石灰等)2）助濾劑（如硅藻土）

目的：改變料液性質、降低濾餅阻力、提高過濾速度工業(yè)過濾設備

板框過濾機

加壓葉濾機

回轉真空過濾機

適用范圍廣泛應用于培養(yǎng)基制備的過濾及多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。優(yōu)點：過濾面積大，結構簡單，價格低，動力消耗少，對不同過濾特性的發(fā)酵液適應性強。缺點：不能連續(xù)操作，設備笨重，勞動強度大，衛(wèi)生條件差，非過濾的輔助時間較長。板框過濾機板框過濾機板框組合示意圖濾布濾框濾板濾布濾板與濾框之間加濾布，借手動螺桿或液壓機構將其壓緊，兩相鄰濾布之間的框間為過濾空間回轉真空過濾機水平回轉真空過濾機特點：能自動連續(xù)操作、節(jié)省人力，過濾的適應性好，能處理粘性、具可壓縮性濾餅及容易堵塞濾布的物料，但真空度受到熱液體或揮發(fā)性液體的蒸汽壓的限制，推動力小。設備費用較貴。轉鼓真空過濾機加壓液濾機特點：在密封條件下過濾，適于無菌操作，機體裝卸簡單，洗滌容易。缺點：造價較高，過濾介質更換復雜。高效密閉管袋式加壓過濾機第二節(jié)細胞破碎胞外產物：某些微生物在代謝過程中將產物分泌到細胞之外的液相中（稱胞外酶），如胰島素、某些細胞因子和疫苗亞單位成分等。胞內產物某些微生物在代謝過程中產物在細胞內（胞內酶）或重組DNA產品（非分泌型），需要應用細胞破碎技術破碎細胞，使細胞內產物釋放到液相中真核細胞一、細胞的結構細胞質內含豐富的細胞器結構簡單，無細胞核，一般由細胞質和核糖體細胞膜的結構原核和真核細胞細胞膜組成相同，均由脂質和蛋白質構成植物細胞植物細胞和微生物細胞有細胞壁，破碎困難，需用強烈的破碎方法動物細胞動物細胞沒有細胞壁，只有細胞膜，易于破碎G+的細胞壁較厚，比G-陰性菌堅固，較難破碎酵母的細胞壁比G+菌的細胞壁厚，更難破碎。不同種類的細胞破碎的難易程度：

植物細胞＞真菌（如酵母菌）＞革蘭氏陽性菌＞革蘭氏陰性菌＞動物細胞（由難到易）生物產物的胞內位置細胞壁、細胞膜、細胞質、線粒體、核糖體、內質網和高爾基體等細胞器中。破碎細胞的目的：

使細胞壁和細胞膜受到不同程度的破壞或破碎，釋放其中的目標產物。二、細胞破碎原理機械破碎的原理

細胞在機械作用力下受到壓縮和剪切而破碎。細胞越小，所需壓縮或剪切力越大，越難破碎?；瘜W破碎的原理

又稱化學滲透，其原理是利用化學或生化試劑（酶）改變細胞壁或細胞膜結構，增大胞內物質的溶出速率；或者完全溶解細胞壁，形成原生質體后，在滲透壓作用下使細胞膜破裂而釋放胞內物質。細胞破碎機理示意圖細胞的破碎率：一般用目標產物的釋放（溶解）速率價率影響破碎率的因素：破碎方法、細胞種類、目標產物的胞內位置三、細胞破碎技術機械破碎法1）高壓勻漿(High-pressurehomogenization)破碎原理：細胞懸液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞受高速撞擊后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在液相剪切力和撞擊力等綜合作用下破碎。各種形式的高壓勻漿器其中：S為細胞破碎率；p為操作壓力；N為循環(huán)操作次數；k為破碎速率常數，與細胞種類和操作溫度有關。主要影響因素：壓力、循環(huán)操作次數和溫度。高壓勻漿器的操作壓力一般為：50－70MPa高壓勻漿法的特點：適用于酵母和大多數細菌細胞的破碎。團狀和絲狀菌易造成高壓勻漿器的堵塞，不宜使用此法。較小的G＋菌以及有些亞細胞器，質地堅硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。

料液細胞濃度可達到200g/L左右。操作溫度上升約２-３℃/10MPa,需要對料液作冷卻處理,以保護目標產物的生物活性2）珠磨破碎破碎原理：在攪拌漿的高速攪拌下，微珠高速運動，細胞和微珠（玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等）之間相互磨擦碰撞而破碎。(固相剪切力和撞擊力）主要影響因素：攪拌速度、細胞濃度、微球粒徑、密度、填充率和接觸時間等。其中：S為細胞破碎率；k為破碎速率常數，與微球粒徑、密度、填充率以及細胞濃度、攪拌速度和攪拌槳形狀等有關；t在間歇操作時為破碎操作時間，連續(xù)操作時t=V/Q(V為破碎室有效體積；Q為細胞懸液的流量）。珠膜的細胞破碎率隨細胞種類而異，但均隨攪拌速度和懸浮停留時間的增大而增大；對于一定的細胞，存在適宜的微珠粒徑，使細胞破碎率最高；細胞懸浮液濃度：60-120g/L(細菌），140-180g/L(酵母）破碎效果較理想。珠磨破碎的特點：適用于絕大多數微生物細胞的破碎，較高壓勻漿法適用范圍廣；有效能量利用率很低(1%)，設計操作時應充分考慮冷卻系統(tǒng)的熱交換能力；影響破碎率的操作參數較多（球粒徑、密度、填充率以及細胞濃度、攪拌速度和攪拌槳形狀），過程優(yōu)化設計較復雜。3）噴霧撞擊破碎破碎原理：細胞懸液以噴霧狀高速冷凍后成為易于破碎的剛性球體，高速撞擊固定的撞擊板使其破碎。噴霧撞擊破碎的特點

細胞破碎均勻，避免過度破碎；可通過調節(jié)載氣壓力控制細胞破碎程度，避免細胞內部結構破壞，適用于細胞器（如線粒體、葉綠體）的回收；適用于大多數微生物細胞和植物細胞的破碎；可處理的細胞懸浮液濃度為100-200g/L

4）超聲波破碎（ultrasonicdisruption)破碎原理：超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，產生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎。影響因素：細胞種類、濃度和超聲波的能量等。特點：強烈的破碎方法，適用于多數微生物的破碎；操作過程產生大量的熱，需在冰水或外部冷卻的容器中進行。對冷卻的要求相當苛刻，不易放大，多在實驗室使用?；瘜W和生物化學破碎法

1）酸堿處理調節(jié)PH值，改變蛋白質的荷電性質，使蛋白間或蛋白與其它物質間的相互作用力降低，提高目標產物的溶解度

2）化學試劑處理破碎原理：用表面活性劑、螯合劑、鹽或有機溶劑、等處理細胞，增大細胞壁或細胞膜的通透性，或者用變性劑（脲或鹽酸胍等）降低胞內物質間相互作用，使目的產物易于釋放。3）酶溶

原理：利用溶解細胞壁的酶（如溶菌酶、纖維素酶）處理菌體細胞，使細胞壁部分或完全破壞，釋放胞內產物。

自溶：通過調節(jié)溫度、PH值或添加有機溶劑，誘使細胞產生溶解自身的酶。（利用生物體自身產生的酶來溶胞，無需外加其他酶）。

酶試劑的選擇：不同的菌體細胞由于細胞壁化學組成不同應選用不同的酶處理：細菌：溶菌酶；酵母細胞：-1,6-葡聚糖酶或甘露糖酶；植物細胞：纖維素酶。酶溶法的特點發(fā)生酶解的條件溫和能選擇性地釋放產物胞內核酸等泄出量少，細胞外形較完整，便于后步分離酶水解價格高，故小規(guī)模應用較廣機械破碎法與化學破碎法的比較機械破碎法優(yōu)點：處理量大、破碎效率高、速度快，適用于工業(yè)規(guī)模的細胞破碎。缺點：操作條件較劇烈，易造成細胞的過度破碎，不利于后處理?；瘜W破碎法優(yōu)點：選擇性高，胞內產物的總釋放率低，料液粘度小，有利于后處理。缺點：適用范圍小，通用性差，破碎速度慢，處理時間長，破碎效率低，不適于大規(guī)模細胞破碎操作。將機械破碎法和化學破碎法結合，可大大提高破碎效率。

物理滲透法1）滲透壓沖擊法破碎原理：細胞在高滲透壓介質（如一定濃度的甘