最后革蘭染色法

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)微生物教研室姓名：余春芳新浪微博：微生物-輕舞飛揚(yáng)QQ郵箱：623358585@平時(shí)成績8分操作考試成績12分說明：曠課：一次扣2分，四次曠課總成績不及格；作業(yè)：教師評(píng)分C以下一次扣0.5分；微生物學(xué)試驗(yàn)課成績計(jì)算微生物實(shí)驗(yàn)課注意事項(xiàng)禁止不穿白大衣進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室；禁止在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)吃東西、吸煙；不得高聲喧嘩，隨處走動(dòng)；嚴(yán)禁用酒精燈點(diǎn)燃酒精燈；嚴(yán)禁把實(shí)驗(yàn)室內(nèi)任何物品帶出室外；病原材料污染桌面、地板等或誤吸入口，應(yīng)立即報(bào)告教師進(jìn)行處理；愛護(hù)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備，損壞儀器要賠償；實(shí)驗(yàn)完畢，廢棄物放入指定地點(diǎn)，桌面理清潔，洗手后方可離室。值日同學(xué)負(fù)責(zé)打掃實(shí)驗(yàn)室，并關(guān)好水電、門窗方可離開。

實(shí)驗(yàn)一革蘭染色法

了解細(xì)菌涂片制作掌握革蘭染色法的原理、方法以及意義掌握油鏡的使用實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊蠹?xì)菌形態(tài)檢查方法染色標(biāo)本的檢查

常用方法：革蘭染色法、抗酸染色法、特殊結(jié)構(gòu)染色法

應(yīng)用：觀察細(xì)菌大小、形態(tài)、排列、染色性、特殊結(jié)構(gòu)，鑒別細(xì)菌不染色標(biāo)本檢查

常用方法：壓滴法、懸滴法、暗視野映光法(P5)應(yīng)用：主要用于觀察活菌的動(dòng)力和運(yùn)動(dòng)方式細(xì)菌染色的方法單染法:采用一種染料染色,只能觀察細(xì)菌的形態(tài)和排列特征，不能觀察細(xì)菌的染色特性和進(jìn)行鑒別。復(fù)染法（鑒別染色）:采用兩種或兩種以上的不同染料進(jìn)行先后染色，使不同種類的細(xì)菌、同種細(xì)菌的不同結(jié)構(gòu)，分別染上不同的顏色，以便鑒別細(xì)菌。革蘭染色法該染色法是用于細(xì)菌分類、鑒別最常用最重要的染色法。是丹麥細(xì)菌學(xué)家革蘭于1884年創(chuàng)建的,至今仍廣泛應(yīng)用。革蘭氏細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的的細(xì)胞壁差異革蘭染色法的原理★滲透學(xué)說：與肽聚糖的結(jié)構(gòu)有關(guān)

革蘭陽性菌細(xì)胞壁主要由致密的肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，酒精不易滲透，反而可使細(xì)胞壁脫水而形成一道屏障，阻止染料向細(xì)胞外滲。革蘭陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，脂類含量高，酒精易滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，將結(jié)合的結(jié)晶紫碘復(fù)合物脫出?！锘瘜W(xué)學(xué)說：與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中核糖核酸鎂鹽有關(guān)

革蘭陽性菌細(xì)胞質(zhì)中的核糖核酸鎂鹽與結(jié)晶紫-碘結(jié)合形成更大的復(fù)合物，不易被酒精脫出?！锏入婞c(diǎn)學(xué)說：與細(xì)菌所帶電荷有關(guān)

革蘭陽性菌等電點(diǎn)低（pI）為2~3，在中性或堿性環(huán)境中所帶負(fù)電荷多；革蘭陰性菌pI為4~5，所帶負(fù)電荷少，影響結(jié)合染色的多少實(shí)驗(yàn)材料與方法材料:

菌種：葡萄球菌和大腸埃希菌混合物（18-24h）

牙垢

試劑：結(jié)晶紫染液、碘液

95%酒精、稀釋苯酚復(fù)紅液其他：玻片、接種環(huán)、酒精燈無菌生理鹽水、顯微鏡等染色標(biāo)本檢查基本程序涂片干燥固定染色鏡檢實(shí)驗(yàn)步驟一、細(xì)菌涂片的制作

取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴單蒸水，按無菌操作法取菌涂片，做成濃菌液。2.再取干凈載玻片一塊將剛制成的濃菌液挑2-3環(huán)涂在玻片兩邊制成薄的涂面，注意取菌不要太多。3.將玻片反復(fù)在酒精燈上方通過幾次（用手指觸摸涂片反面，以不燙手為宜），對(duì)標(biāo)本進(jìn)行干燥、固定（也可自然干燥）。待涂片冷卻后，再加染色液。涂片制作1.初染：在涂片上加結(jié)晶紫（以蓋滿細(xì)菌涂面為宜），染色 約1分鐘后水洗。2.媒染：滴加碘液染色1分鐘，水洗。3.脫色：把玻片上的水吸凈，用95%酒精滴洗玻片，直到滴出 的酒精剛好不出現(xiàn)紫色，大約30秒鐘，立即用水洗。4.復(fù)染：滴加稀釋苯酚復(fù)紅染液染色30秒鐘，水洗后涂片用吸水紙吸干或者放空氣中晾干。二、革蘭氏染色AProceduresofGramStaining初染媒染脫色復(fù)染結(jié)晶紫1分鐘碘液1分鐘95%酒精30秒稀釋苯酚1分鐘(1)先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察，找出適當(dāng)?shù)囊曇啊?2)將高倍鏡轉(zhuǎn)出，然后在涂片上加香柏油一滴。(3)將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的顏色和形態(tài)。三、涂片觀察P3四實(shí)驗(yàn)完畢后的處理：1.將浸過油的鏡頭按照下述方法擦拭干凈：a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯（）將鏡頭擦2-3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2-3次。`注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭。2.鏡檢后的染色玻片用紙將香柏油擦干凈。1.涂片后要注意固定、干燥，以免標(biāo)本被沖洗掉。注意事項(xiàng)2.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。

如果脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌。

如果脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被染成革蘭氏陽性菌。

脫色時(shí)間的長短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格界定。4.選用幼齡的細(xì)菌。選用培養(yǎng)16h-24h菌齡的細(xì)菌為宜。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。3.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。金黃色葡萄球菌(10×40)大腸桿菌(10×40)染色結(jié)果染色結(jié)果螺形菌Spiralbacterium革蘭染色意義★有助于鑒別細(xì)菌★有助于選擇抗菌藥物★有助于研究細(xì)菌的致病性選擇抗菌藥物革蘭氏陽性菌：葡萄球菌屬（主要是金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、鏈球菌屬（肺炎鏈球菌、草綠色鏈球菌、腸球菌等）、白喉?xiàng)U菌、炭疽桿菌、破傷風(fēng)桿菌、蠟樣芽孢桿菌等，其中，金黃色葡萄球菌、腸球菌等為臨床重要等病原菌革蘭氏陽性菌通常對(duì)青霉素類、第一（或第二）代頭孢菌素等高度敏感，青霉素可為化膿性細(xì)菌感染可首選藥物。選擇抗菌藥物革蘭氏陰性菌：沙門氏菌屬、志賀氏菌屬（痢疾桿菌等）、嗜血桿菌屬（杜克雷嗜血桿菌、流感嗜血桿菌等）、霍亂弧菌等。革蘭氏陰性菌在院內(nèi)感染中的細(xì)菌感染中占了大約65%，且大多菌株容易對(duì)抗菌藥物耐藥革蘭氏陰性菌對(duì)第三代頭孢菌素、氨基糖苷類、抗假單胞菌屬的青霉素類、多粘菌素等高度敏感，對(duì)頭霉素類和第二代頭孢菌素也較敏感。例如氟哌酸對(duì)革蘭染色陰性桿菌有效，如腸道病、腹瀉為常用藥。研究細(xì)菌的致病性革蘭陽性菌可產(chǎn)生外毒素致病。革蘭陰性菌主要以內(nèi)毒素致病。（LPS作為G-菌內(nèi)毒素致?。?shí)驗(yàn)思考1.為什么革蘭氏染色后細(xì)菌會(huì)分出兩種顏色？2.革蘭氏染色最關(guān)鍵的是哪一步，此時(shí)陽性菌和陰性菌各應(yīng)該是哪種顏色，不經(jīng)過復(fù)染這一步能不能區(qū)別革蘭氏陽性菌和陰性菌？3.固定的目的之一是殺死細(xì)菌，這與用自然死亡的菌體進(jìn)行染色有什么不同?實(shí)驗(yàn)步驟觀看鞭毛、莢膜、芽孢的示范片繪圖、寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告細(xì)菌的特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)芽胞(nuclearmater