第二章 細胞分離等-生物工程下游技術(shù)

第二章發(fā)酵液預(yù)處理，細胞的分離、破碎第一節(jié)發(fā)酵液預(yù)處理目的：分離菌體和其他懸浮顆粒；除去部分雜質(zhì)和改變?yōu)V液性質(zhì)發(fā)酵液的性質(zhì)：產(chǎn)物濃度較低懸浮顆粒小固體粒子可壓縮性大粘度大性質(zhì)不穩(wěn)定第一節(jié)發(fā)酵液預(yù)處理常用的發(fā)酵液預(yù)處理方法：降低液體的粘度：水稀釋法、加熱法調(diào)整pH值凝聚和絮凝凝聚：在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，從而膠體體系不穩(wěn)定。絮凝：在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團的過程。

混凝：前兩者的復(fù)合使用。第一節(jié)發(fā)酵液預(yù)處理加入助濾劑助濾劑：不可壓縮的多孔微粒。硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖等。懸浮液中大量的細微粒子吸附到助濾劑的表面上，其可壓縮性下降了，濾餅疏松，過濾阻力降低了。加入不影響目的產(chǎn)物的反應(yīng)劑第二節(jié)細胞分離A.重力沉降：細胞體積小，沉降速度很慢使細胞聚集成較大的凝聚顆粒，提高沉降速度

高分子絮凝劑：聚丙烯酰胺、聚乙烯酰胺等無機的凝聚劑：中性鹽（硫酸鋁、氯化鈣等）細胞分離—B.離心沉降離心分離法：

1.差速離心（Differentialcentrifugation）

生化工業(yè)中最常用的離心分離法，細胞的分離為一級分級分離。實際應(yīng)用中據(jù)實際物系的特點、分離目的和所需分離程度，選擇適當?shù)碾x心機轉(zhuǎn)數(shù)和時間，可使料液中不同組分得到分級分離。

2.區(qū)帶離心（Zonalcentrifugation）

事先在離心管中用某種低分子溶質(zhì)調(diào)配好密度梯度，再加待處理料液后進行離心。離心時，料液中各組分在密度梯度中以不同的速度沉降，形成各自的區(qū)帶而得到分離。蔗糖、CsCl、NaBr密度梯度溶液細胞分離—B.離心沉降離心分離法：低速離心，高速離心，超速離心過濾式離心，沉降式離心冷凍離心：低溫下操作細胞分離—B.離心沉降離心分離設(shè)備：實驗室用離心機：離心管式轉(zhuǎn)子離心機間歇式操作各種形式的離心機轉(zhuǎn)子細胞分離—B.離心沉降工業(yè)用離心機：可連續(xù)操作管式離心機，蝶片式離心機管式離心機

管式離心機能澄清及分離流體物質(zhì)，被應(yīng)用于化學(xué)、生物化學(xué)、制藥、血漿等研究領(lǐng)域。設(shè)備簡單，分離效率高；但生產(chǎn)能力較小。碟式離心機碟式離心機是沉降式離心機中的一種，用于分離難分離的物料（例如粘性液體與細小固體顆粒組成的懸浮液或密度相近的液體組成的乳濁液等）。碟式分離機是應(yīng)用最廣的沉降離心機。碟式離心機可以完成兩種操作：(1)液-固分離，稱澄清操作；(2)液-液（或液-液-固）分離（即乳濁液的分離），稱分離操作。細胞分離—C.過濾過濾（Filtration）：

利用多孔性介質(zhì)截留懸浮液中的固體粒子，進行固液分離的方法。

Filtrationseparatessolidfromaliquidbyforcingtheliquid

througha

solid

supportorfiltermedium.

細胞分離—C.過濾通常發(fā)酵液的黏度大，其中的微生物體積小，造成過濾的困難

Howeverthesmallsizeofmicroorganismsmakefiltrationof

biologicalsolutionsconsiderablymorecomplicated.Generally,fermentationbeersandotherbiologicalsolutionsarehardtofilterbecauseofthehighviscosityorhighlycompressiblecakes.

在過濾前，一般需對料液進行絮凝或凝聚等預(yù)處理，此外可添加助濾劑提高過濾速度。細胞分離—C.過濾過濾方法：澄清過濾，濾餅過濾：P53重力過濾，加壓過濾，真空過濾，離心過濾切向流過濾：P57-細胞分離—C.過濾過濾設(shè)備：板框過濾機用于各種懸浮液的固液分離，適用范圍廣。應(yīng)用于食品、環(huán)保、輕工、醫(yī)藥、化工、冶金、石油等工業(yè)。特別適用于大批量啤酒、白酒、葡萄酒、食用油等液體飲料的精濾或除菌過濾。板框過濾機細胞分離—C.過濾板框壓濾機1.結(jié)構(gòu)：若干板，框交替排列，板，框都用支耳架在一對橫梁上，用壓緊裝置壓緊或拉開。2.濾板結(jié)構(gòu)：凹凸紋路作用支撐濾布，提供濾液或洗滌液的流道。分為洗滌板和非洗滌板兩種。3.濾框結(jié)構(gòu)：有供料漿通過的暗孔，料漿在壓差的推動下籍框兩側(cè)覆蓋的濾布進行過濾分離。4.過濾操作液體流動路徑：料漿沿1通道輸入，通過濾框的暗孔進入濾框，框中的料漿在壓差的推動下籍框兩側(cè)覆蓋的濾布進行過濾分離。濾餅在框內(nèi)兩側(cè)生成并增長，濾液通過濾布流到濾板板面的凹槽后因板面凹槽有暗孔與2、4通道相連或與3通道相連，故濾液可由三條通道流到過濾機外。細胞分離—C.過濾硅藻土過濾機：硅藻土的使用方法：作為過濾介質(zhì)作為支持介質(zhì)加入到懸浮液中按支撐單元分：板框過濾機，葉片式過濾機等第三節(jié)細胞破碎許多生物產(chǎn)物在細胞培養(yǎng)過程中不能分泌到胞外，而保留在細胞內(nèi)。破碎細胞的目的就是使細胞壁和細胞膜受到不同程度的破壞或破碎，釋放其中的目標產(chǎn)物。細胞破碎應(yīng)考慮破碎細胞的結(jié)構(gòu)微生物細胞,

動物細胞,

植物細胞真核細胞：細胞壁成分為纖維素或幾丁質(zhì)，或兼有該兩種成分。

不同種類的細胞結(jié)構(gòu)差別很大，破碎的難易程度也不同，由難到易的大致排列順序為：植物細胞＞真菌（如酵母菌）＞革蘭氏陽性細菌＞革蘭氏陰性細菌＞動物細胞。革蘭氏陽性細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)革蘭氏陽性（G+）細菌的細胞壁具有較厚（30-40nm）而致密的肽聚糖層，多達20層磷壁酸：是革蘭氏陽性菌的特有的成分，可加強肽聚糖的結(jié)構(gòu)。革蘭氏陰性細菌的細胞壁革蘭氏陰性細菌的外膜壁膜間隙O-特異多糖(O-polysaccharide)核心多糖(core-polysaccharide)蛋白質(zhì)類脂A(LipidA)孔蛋白(脂多糖)磷脂分子脂蛋白細胞破碎目標產(chǎn)物的選擇性釋放

選擇性釋放目標產(chǎn)物，使其他物質(zhì)盡量少地釋放出來，并盡量降低細胞的破碎程度，對下游分離純化有利。細胞破碎一、機械破碎：

機械破碎的原理是細胞在機械作用力下受到壓縮和剪切而破碎。細胞越小，所需壓縮或剪切力越大，越難破碎。處理量大、效率高、速度快，是工業(yè)規(guī)模的主要手段

1.高壓勻漿：

破碎原理：主要利用細胞懸液在高壓作用下液相剪切力以及細胞與固定表面的撞擊力而使之破碎。

壓力通常為20-70MPa

適用于酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎需冷卻處理，以保護產(chǎn)物的生物活性細胞破碎2.珠磨

破碎原理：利用在高速攪拌作用下，細胞和微球相互磨擦碰撞而破碎。細胞受研磨剪切和撞擊而破碎特點：適用范圍較廣；但有效能量利用率很低，設(shè)計操作時應(yīng)充分考慮冷卻系統(tǒng)的熱交換能力；影響破碎率的操作參數(shù)較多。3.撞擊破碎細胞冷凍后成為剛性球體，再進行高速撞擊而破碎特點：細胞破碎均勻；可通過調(diào)節(jié)載氣壓力控制細胞破碎程度；適用于細胞器（如線粒體、葉綠體）的回收。4.超聲波破碎

破碎原理：超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎。影響因素：細胞種類、濃度和超聲波的能量等。特點：適用范圍廣,適用于多數(shù)微生物細胞的破碎。但有效能量利用率極低，操作中產(chǎn)生熱，需在冰水或有外部冷卻的容器中進行,故不易放大，多在實驗室使用。細胞破碎二、化學(xué)和生物化學(xué)法1.酸堿處理2.化學(xué)試劑處理：增大細胞壁通透性表面活性劑、螯合劑、有機溶劑、變性劑3.酶溶：利用溶解細胞壁的酶處理細胞不同的細胞用不同的酶：如溶菌酶適用于細菌；而酵母細胞的酶溶需用Zymolyase、-1,6-葡聚糖酶或甘露糖酶；破壞植物細胞則用纖維素酶。4.自溶：通過調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機溶劑，誘使細胞產(chǎn)生溶解自身的酶的方法。

機械破碎法與化學(xué)破碎法的比較機械破碎法優(yōu)點：處理量大、破碎效率高、速度快，適用于工業(yè)規(guī)模的細胞破碎。缺點：由于操作條件比較劇烈，往往容易造成細胞的過度破碎，不利于后續(xù)處理?；瘜W(xué)破碎法優(yōu)點：選擇性高，胞內(nèi)產(chǎn)物的總釋放率低，料液粘度小，有利于后處理過程。缺點：適用范圍小，通用性差，破碎速度慢，處理時間長，破碎效率低，不適于大規(guī)模細胞破碎操作。由以上比較可知，兩種方法各有利弊，把二者結(jié)合起來使用，則可起到取長補短的作用，能夠得到很好的破碎效果。細胞破碎三、物理滲透法

1.滲透壓沖擊法：破碎原理：細胞在高滲透壓介質(zhì)中平衡后，再突然將其轉(zhuǎn)至低滲透壓環(huán)境中，水會大量進入細胞，使細胞壁和膜脹破。特點:溫和，適用于易于破碎的細胞（動物細胞和革蘭氏陰性菌）

2.凍結(jié)-融化法細胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，此操作反復(fù)進行多次，使細胞受到破壞。破碎原理：利用細胞在快速冷凍時，細胞內(nèi)水很快結(jié)晶，形成大量晶核，體積增大，將細胞脹破，經(jīng)凍結(jié)－融化反復(fù)多次操作，即可達到所需的破碎率。特點：此法主要適用于大腸桿菌和細胞壁較薄的細胞，特別適用于位于胞間質(zhì)的酶的釋放；操作方便，但耗時、耗能，大規(guī)模應(yīng)用困難。細胞破碎細胞破碎破碎率的測定：直接測定法目標產(chǎn)物測定法導(dǎo)電率測定法細胞破碎研究和發(fā)展方向：多種破碎方法相結(jié)合與下游過程相結(jié)合與上游過程相結(jié)合：細胞的培養(yǎng)條件、基因工程等包含體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性包含體（inclusionbodies,Ibs）：很多利用大腸桿菌為宿主細胞的外源基因表達產(chǎn)物不分泌到細胞外，而在細胞內(nèi)凝聚成的無生物活性的固體顆粒。包含體中基因表