高效液相色譜儀的原理及應(yīng)用

高效液相色譜儀的原理及應(yīng)用2023/2/5一、高效液相色譜法的定義和分類流動(dòng)相是液體的色譜稱為液相色譜（LC）。在液相色譜中，采用顆粒十分細(xì)的高效固定相，并采用高壓泵輸送流動(dòng)相，全部工作通過儀器完成，這種色譜稱為高效液相色譜（HPLC）

。第一節(jié)高效液相色譜法原理2023/2/5一、高效液相色譜法的定義和分類液相色譜：平板色譜和柱色譜。液相色譜：分配色譜、液固色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜。氣相色譜：揮發(fā)性物質(zhì)，不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)分析。液相色譜：可分析各種物質(zhì)，熱不穩(wěn)定物質(zhì)，但流動(dòng)相有毒，運(yùn)行操作比GC難。能用GC就用GC。2023/2/5二、液相色譜中常用術(shù)語和參數(shù)只針對(duì)HPLC特有的，其余術(shù)語與第三章同。粒間體積（V0）：色譜柱填充劑顆粒間隙中流動(dòng)相所占有的體積?？左w積（Vp）

：色譜柱中多孔填充劑的所有孔洞中流動(dòng)相所占有的體積。2023/2/5二、液相色譜中常用術(shù)語和參數(shù)柱外體積（Vext）：從進(jìn)樣系統(tǒng)到檢測(cè)器之間色譜柱以外的液路部分中流動(dòng)相所占有的體積。液體總體積（Vtot）

：粒間體積、孔體積和柱外體積之和。淋洗體積（V）：從進(jìn)樣開始計(jì)算的通過色譜柱的實(shí)際淋洗體積。2023/2/5三、反相高效液相色譜由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱），代表性的流動(dòng)相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式。溶質(zhì)在填料表面的烴類和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。溶質(zhì)在吸附于填料表面烴類上的“改良固定相”和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配溶質(zhì)被吸附于填料表面烴類分子上，類似吸附色譜。2023/2/5四、正相高效液相色譜是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動(dòng)相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動(dòng)相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。溶劑洗脫強(qiáng)度近似地隨溶劑的介電常數(shù)增加而增大，洗脫能力越弱，溶質(zhì)在柱上保留時(shí)間越長(zhǎng)。2023/2/5第二節(jié)高效液相色譜儀的組成Agilent11002023/2/51.輸液系統(tǒng)2.進(jìn)樣系統(tǒng)3.分離系統(tǒng)4.檢測(cè)系統(tǒng)5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)一高效液相色譜儀系統(tǒng)高壓泵流動(dòng)相溶劑廢液色譜柱進(jìn)樣口檢測(cè)器2023/2/51、輸液系統(tǒng)

貯液裝置脫氣裝置高壓輸液泵梯度淋洗系統(tǒng)輸液系統(tǒng)的功能:

1.提供足夠的驅(qū)動(dòng)力使流動(dòng)相通過填充柱2.使流動(dòng)相流量精確和穩(wěn)定3.使流動(dòng)相組成精確2023/2/5

分析用高效液相色譜的流動(dòng)相貯罐，常用1L的錐形瓶加一個(gè)電磁攪拌器，在連接到泵入口處的管線上要加一個(gè)過濾器。

(1)貯液裝置2023/2/5(2)脫氣裝置用于脫去流動(dòng)相中的溶解氣體，流動(dòng)相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱。脫氣機(jī)、超聲脫氣、真空脫氣等。

2023/2/5(3)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。μL/min~幾千mL/min應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2023/2/5(4)梯度淋洗裝置2023/2/5等度洗脫輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器單一或混合溶劑2023/2/5分析時(shí)間長(zhǎng)分離度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2等度洗脫怎樣解決呢？2023/2/5梯度洗脫

A泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器

B泵AB時(shí)間B濃度2023/2/595%30%MeOH梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時(shí)間、降低最小檢測(cè)量和提高分離精度。2023/2/5

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置：2、進(jìn)樣系統(tǒng)2023/2/5

高效分離柱直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～8mm，柱長(zhǎng)5～40cm。3、分離系統(tǒng)2023/2/5色譜柱填料C18色譜柱十八烷基硅基化學(xué)鍵合到多孔硅膠或陶瓷微粒SIL多孔硅膠微粒ZORBAXEclipseXDB-C8辛基硅烷化學(xué)鍵合到多孔硅膠微粒上2023/2/5柱的保養(yǎng)：1.柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)；2.當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈；3.要注意流動(dòng)相的脫氣；4.避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相；5.進(jìn)樣樣品要預(yù)先提純；6.嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；7.每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；8.每天分析測(cè)定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?.若分析柱長(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；2023/2/51）柱壓低于150kg/cm2（15cm色譜柱）2）柱溫在40℃左右，最高使用溫度為50℃3）流動(dòng)相pH使用范圍為2～7.5ODS柱的使用注意點(diǎn)：2023/2/5目前最常用的檢測(cè)器主要有：紫外-可見檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器折光示差檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器4、檢測(cè)系統(tǒng)2023/2/5

a.紫外檢測(cè)器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。

UV燈光柵流通池參考二極管采樣二極管截止棱鏡氧化鈥濾光片狹縫鏡2鏡12023/2/5b.光電二極管陣列檢測(cè)器紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。2023/2/5c.熒光檢測(cè)器高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴、維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。2023/2/5d.質(zhì)譜檢測(cè)器：2023/2/5二、高效液相液相色譜固定相和流動(dòng)相

1.固定相（1）全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；2023/2/5（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N2023/2/52.流動(dòng)相

按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。2023/2/5流動(dòng)相選擇

在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2023/2/5

1、環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動(dòng)相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測(cè)器：折光示差檢測(cè)器

可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。第三節(jié)HPLC的應(yīng)用2023/2/52、稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動(dòng)相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC柱壓：70104Pa

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器2023/2/5例：液相色譜法測(cè)定食品中苯并(a)芘原理：樣品經(jīng)過提取、皂化以及柱層析凈化，除去脂肪類物質(zhì)、色素等雜質(zhì)后，再通過液相色譜儀中的色譜柱，將苯并芘從多環(huán)芳烴物質(zhì)中分離出來。求出樣品中苯并芘的含量。儀器：(1)液相色譜儀：色譜柱：ODS柱，柱長(zhǎng)250mm，Φ4mm；

柱溫：30℃；流動(dòng)相：75％甲醇；流速：2mL／min。(2)檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)369nm，熒光波長(zhǎng)405nm。2023/2/5操作步驟：(1)定性測(cè)定用微量注射器吸取一定量的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣液，注入色譜儀內(nèi)，根據(jù)苯并芘的出峰保留時(shí)間和樣品中加標(biāo)準(zhǔn)樣產(chǎn)生重疊的情況進(jìn)行定性。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用微量注射器準(zhǔn)確吸取每1mL含1μg的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5uL按照上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行操作，以獲得相應(yīng)的色譜圖。然后，分別測(cè)量各個(gè)色譜的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)苯并芘量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)樣品的測(cè)定：在上述實(shí)驗(yàn)條件下，吸取一定量經(jīng)過柱凈化的樣品提取液，注入液相色譜儀中進(jìn)行分離、分析，測(cè)得峰面積，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)于此面積的苯并芘含量。2023/2/5

Waters515高效液相色譜泵，Wa