專題2-課題2-土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用一.研究思路㈠.篩選菌株：實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等，采用選擇培養(yǎng)分離的方法，或抑制使大多數(shù)微生物不能生長(zhǎng)，或造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境，經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純培養(yǎng)分離。一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)脲酶+CO2NH3+H2O4、課題目的①?gòu)耐寥乐蟹蛛x出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。什么是選擇性培養(yǎng)基？15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：①?gòu)奈锢硇再|(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：1.直接計(jì)數(shù)法：這種方法是利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點(diǎn)是不能區(qū)分死菌和活菌。每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)2.間接計(jì)數(shù)法(活菌計(jì)數(shù)法)：⑴原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。⑶注意事項(xiàng)每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。這是因?yàn)閮蓚€(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。④涂布平板法所選擇倒平板的稀釋度很重要，一般以三個(gè)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。除上述兩種常用的計(jì)數(shù)方法外，還有膜過濾法、比濁法。膜過濾法是當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上(或一定面積中)的細(xì)菌數(shù)；比濁法原理是在一定范圍內(nèi)，菌的懸液中細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下，測(cè)定菌懸液的光密度，以光密度表示菌量。實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。微生物計(jì)數(shù)法，發(fā)展迅速，現(xiàn)有多種多樣的快速、簡(jiǎn)易、自動(dòng)化的儀器和裝置等方法。㈢.設(shè)置對(duì)照：對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了被測(cè)試條件以外，其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)，其作用是比照實(shí)驗(yàn)組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實(shí)是所測(cè)試和條件引起相應(yīng)的結(jié)果。設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。P22旁欄思考題想一想，如何從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)？答：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。

P23討論問題A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。究竟是哪個(gè)原因，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。實(shí)驗(yàn)方案有兩種。一種方案是可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。另一種方案是將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。二.實(shí)驗(yàn)的具體操作

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。㈢.樣品的稀釋：◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。將稱好的土樣倒入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，塞好棉塞?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行?！舴蛛x不同的微生物采用不同的稀釋度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計(jì)數(shù)的平板。細(xì)菌稀釋度為104、105、106，放線菌稀釋度為103、104、105，真菌稀釋度為102、103、104。P24旁欄思考題：為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量（單位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。㈣.取樣涂布◆實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。◆如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。

◆為了提高效率，在操作時(shí)更加有條不紊，應(yīng)當(dāng)事先規(guī)劃時(shí)間。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌一般在30～37℃培養(yǎng)1～2d，放線菌一般在25～28℃培養(yǎng)5～7d，霉菌一般在25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。思考與討論在微生物培養(yǎng)過程中，為什么每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目？菌種鑒定的依據(jù)是什么？答：不同種類的微生物，往往需不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間，每隔24h統(tǒng)計(jì)1次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。不同種類的細(xì)菌形成的菌落，在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作為菌種鑒定的重要依據(jù)。三.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30——300個(gè)菌落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。四.課外延伸在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。

1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）A.培養(yǎng)細(xì)菌B.培養(yǎng)真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀，與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實(shí)踐訓(xùn)練CD3.下列說法不正確的是（）A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、