園藝植物生物技術(shù)第七章

Chapt7

GeneticEngineeringofHorticulturePlantgeneEnhancerelementcontrollingsequencesStructuralgeneWhatisgene?Genecanbedefinedasasegmentofgenomewithaspecificsequenceofnucleotides,whichhasaspecificbiologicalfunction.UpstreamelementTATAboxExonExonExonintronintronintron

GeneticEngineering

alsocalledgenetic

modification,isthedirectmanipulationofanorganism'sgenomeusingbiotechnology.

NewDNA

maybeinsertedinthehostgenomebyfirstisolatingandcopyingthegeneticmaterialofinterestusingmolecularcloningmethodstogenerateaDNAsequence,orbysynthesizingtheDNA,andtheninsertingthisconstructintothehostorganism.

Genesmayberemoved,or"knockedout",usinganuclease.Genetargetingisadifferenttechniquethatuseshomologousrecombinationtochangeanendogenousgene,andcanbeusedtodeleteagene,removeexons,addagene,orintroducepointmutations.Anorganismthatisgeneratedthroughgeneticengineeringisconsideredtobeageneticallymodifiedorganism(GMO).ThefirstGMOswerebacteriain1973.Geneticallymodifiedcrops(GMCs,GMcrops).Thefirstgeneticallymodifiedplantwasproducedin1982,usinganantibiotic-resistanttobaccoplant.ThefirstgeneticallymodifiedcropapprovedforsaleintheU.S.,in1994,wastheFlavrSavrtomato,whichhadalongershelflife.7.1InstrumentalEnzymeof

GeneEngineeringRestrictionendonucleases(限制性內(nèi)切酶)Ligase（連接酶）Polymerase（聚合酶）Nuclease（核酸酶）Terminalenzyme（末端轉(zhuǎn)移酶）Methylase（甲基化酶）7.1.1RestrictionEndonuclease一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中某一特定核苷酸序列，并能對(duì)核酸內(nèi)部的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一種內(nèi)切核酸酶。TypeⅠendonuclease：識(shí)別專一位點(diǎn)，切割不專一；TypeⅡendonuclease：識(shí)別專一位點(diǎn)，切割專一；TypeⅢendonuclease：識(shí)別專一位點(diǎn)，切割不專一。TypeⅡendonucleaseRecognize：4~6個(gè)核苷酸，回文序列Cutingresult：astickyends(粘性末端)：Pst1EcoR15’-CTGCA

G-3’5’-G

AATTC-3’3’-G

ACGTC-5’3’-CTTAA

G-5’

abluntends(平末端)：NruⅠ5’TCG

CGA3’5’AGC

GCT3’Isoschizomers(同裂酶)：指來(lái)源不同，但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。如：HpaⅡ和MspⅠ是一對(duì)同裂酶(CCGG)Isocaudarner(同尾酶)：指來(lái)源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。BamHⅠ

BclⅠG

GATCC

TGATC

ACCTAGG

ACTAGT7.1.2DNAligase

（DNA連接酶）T4DNA

ligase：joinbluntendsorstickyendsEscherichiacoliDNA

ligase：joinstickyends7.1.3DNApolymeraseDNA

polymeraseⅠofE.coli：

5’→3’聚合活性，5’→3’外切活性,3’→5’外切活性2.KlenowfragmentofDNApolymeraseⅠofE.coli

5’→3’聚合活性，3’→5’外切活性3.DNA

polymeraseofPhageT4

5’→3’聚合活性，3’→5’外切活性，活性高200倍。4.Reversetranscriptase(反轉(zhuǎn)錄酶)5.DNA

polymeraseofT7phage：活性高1000倍7.1.4

OtherDNA-modifyingenzymesTerminaltransferase(末端轉(zhuǎn)移酶)：能以具3’-OH的單鏈和雙鏈的DNA為引物，在有底物dNTP和Mg2+和Co2+下，把脫氧核苷酸一個(gè)接一個(gè)加到DNA的3’端上。

Alkalinephosphatase(堿性磷酸酶)：在堿性條件下（pH8~9），可除去DNA、RNA

5’端磷酸基團(tuán)，使5’端變?yōu)?OH。防止DNA的自身連接，方便5’端的放射性標(biāo)記。

Methylase(甲基化酶)：通過(guò)對(duì)DNA分子上的特定序列位點(diǎn)進(jìn)行甲基化修飾，使該序列免受能識(shí)別和切割該序列的限制性內(nèi)切核酸酶的切割。

Nuclease

S1(S1核酸酶)：能降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5’磷酸的單核甘酸或寡核甘酸。7.2Vectors（載體）Vector：能把外源DNA帶進(jìn)宿主細(xì)胞，并使之在細(xì)胞內(nèi)建立穩(wěn)定的遺傳狀態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)繁殖、傳代或進(jìn)行表達(dá)。Avecctorshouldhavethefollowingfeatures：Containareplicon,能自主復(fù)制Markergenes,可供選擇的遺傳標(biāo)記Uniquecleavagesite,克隆位點(diǎn)ContainsuitablecontrolelementsforexpressionofclonedDNA,suchaspromoters,terminators,控制元件7.2.1Plasmids(質(zhì)粒)Plasmidsaredouble-stranded,colsedcircularDNAmolecules,whichexitstinthecellasextrachromosomalunits.存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小1~500bp?？勺陨韽?fù)制和表達(dá)，常有1~3個(gè)抗藥性基因，便于篩選。經(jīng)過(guò)適當(dāng)改選后便可成為良好的載體?？寺⊥庠碊NA片段＜10kb（4363bp）oripBR322wasoneofthefirstcloningvectorstobeconstructedandthemostwidelyused.

Itisa4.36kbdoublestrandedcloningvecctor.ItcontainsColE1oriofreplicationandtwoantibiotic-resistancegenesand20uniquerecognitionsites.TheinsertedDNAfragmentwaslessthan10kb.pUCVectors1、2.7kbandpossessColE1oriofreplication；

2、amprR（氨芐青霉素抗性）gene,不含核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別位點(diǎn)。

3、operon(啟動(dòng)子)oflacZ（大腸桿菌β-半乳糖基因）andcodingα-肽鏈的DNA序列；

4、MCS(多克隆位點(diǎn))locatedinlacZ’

gene。MCS不破壞該基因的功能。在含氨芐青霉素、x-gal和IPTG培養(yǎng)基上，未轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不能生長(zhǎng)，藍(lán)色菌落為野生型pUC，白色菌落為重組pUC。7.2.2λ

phage(噬菌體)vectorphage15kb＜insertedDNAfragment＜23kbVirusesthatcaninfectbacteria.48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)Lyticphase

(Replicateandrelease)Lysogenicphase(integrateintohostgenome)VectorcarryLacZ'gene：在誘導(dǎo)物IPTG和X-gal存在時(shí)，β-半乳糖苷酶與相應(yīng)的Lac-宿主鋪平板可形成深藍(lán)色噬菌斑。當(dāng)插入外源基因時(shí)，所產(chǎn)生的重組噬菌體喪失α互補(bǔ)能力，形成無(wú)色噬菌斑。Theimmunefunction(免疫功能失活載體)：載體基因組中有一段免疫區(qū)（酶切位點(diǎn)），外源基因插入失活，無(wú)法進(jìn)入溶原周期，形成清晰噬菌斑。7.2.3Cosmid(柯斯質(zhì)粒)vectorsThevectorshavingbothcos（cohesive）ofλphageandoriofreplicationofplasmid。Cosmidvectors可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞,但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。COSmidpHC79is4.3kb

DNAfragmentandmadeofpBR322andcossiteofλphage.InsectionDNAfragmentmorethan40kb。7.2.4Artificialchromosomevectorsbacterialartificialchromosome,（BAC,細(xì)菌人工染色體）yeastartificialchromosome,（YAC,酵母人工染色體載體）Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNA.CMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistance.oriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumber.cosNisthecossitefromlphage.HindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinserted.Thetwopromotersarefortranscribingtheinsertedfragment.TheNotIsitesareusedforcuttingouttheinsertedfragment.7.3Gene

cloning

Genelibraryscreening（文庫(kù)篩選法）Map-basedcloning(圖位克隆技術(shù))Transposontag（轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法）Differentialdisplayanalysis（基因差異表達(dá)分析）Homologysequences（同源序列法）Genechip（基因芯片技術(shù)）Strategy7.3.1GenelibraryscreeningGenelibrary：是一組DNA或cDNA序列克隆的集合體。Type：genomiclibrary（基因組文庫(kù)）cDNAlibrary(cDNA文庫(kù))(1)GenomicCloning①Vectorpreparation：Thenumberofrecombinantsforacompletegenomiclibrarycanbeestimated：

N=ln(1-P)/ln(1–f)(P=任一基因被克隆的概率)(f=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小)

Example:genomicsoftonatowas9.5×108bp，基因文庫(kù)中克隆片段的平均大小為20kb，則構(gòu)建一個(gè)完備性為0.99的基因文庫(kù)至少需要N=2.2×105

cloning。②PreparationoflongDNAfragment

盡可能避免機(jī)械切割

部分消化：低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋，再酶切。一般可得到＞600kb的DNA.③JunctionofgenomicDNAwithvectors（比例1:15）④Genetictransformation（電轉(zhuǎn)化）⑤Cloneselectionandverification

（隨機(jī)，脈沖電泳）⑥Libraryamplification,packagingandpreservation(2)cDNAlibraryPreparatonofmRNA：oligo(dT)SynthesisoffirststrandofcDNA:reversetranscriptasesSynthesisofsecondstrandofcDNA:RNA-cDNA雜合分子AAAA(A)nTTTT(T)nRNA酶H,大腸桿菌DNA聚合酶IAAAA(A)nTTTT(T)nAAAA(A)nTTTT(T)nAAAA(A)nTTTT(T)nRNA片段為引物合成第二鏈T4DNA聚合酶置換合成CloningofcDNA：Mondify：cDNA甲基化處理，保護(hù)內(nèi)部酶切位點(diǎn)，添加接頭。cloning：將cDNA克隆到載體中。關(guān)鍵是cDNA與載體的比例。PCR介導(dǎo)法Introductiontohostcells(3)

ScreentheinterestinggeneAccordingtonucleotidesequenceofgene相關(guān)基因→DNA探針→雜交Accordingtoexpressionofgene氨基酸序列→合成cDNA探針→雜交ScreenbyPCR

7.3.2Map-basedcloningMap-basedcloning(圖位克隆法)：identificationofDNAmarkerlinkedtotargetgeneonthegeneticmap，thenapproachtoandisolationthegenesbychromosomejumpingorchromosomelanding.Produre：目的基因的初步定位精細(xì)定位構(gòu)建目的基因的精細(xì)物理圖譜并鑒定出含目的基因的小DNA片段篩選文庫(kù)以找出目的基因并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)其表型功能。

7.3.3Transposontagging(轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽)andT-DNAtaggingTransposonistheDNAsequencecanmoveonachromosome.能從一個(gè)基因座位轉(zhuǎn)移到另一個(gè)基因座位，當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到某個(gè)基因內(nèi)部或鄰近位點(diǎn)時(shí)，會(huì)使插入位置的基因失活并誘導(dǎo)突變型；當(dāng)轉(zhuǎn)座子切離時(shí)，又使目的基因恢復(fù)活性。Transposontagging：localizationandcloningagene

usingtransposoninsertion

causingonegeneinactivation.Procedure：轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入目標(biāo)植物篩選獲得純合突變株構(gòu)建突變體核基因組文庫(kù)轉(zhuǎn)座子片段作探針進(jìn)行雜交獲得轉(zhuǎn)座子側(cè)翼序列野生型植物核DNA獲得完整目的基因構(gòu)建野生型核基因組文庫(kù)T-DNAtaggingPrinciple

Likethetransposontaggingmethod，ButusingT-DNAofTiplasmidinagrobacterium(農(nóng)桿菌)causemutant，andfindorseparatagene。7.3.4Analysisofgenedifferentialexpression

基因差異表達(dá)分析Variousprocessesoflifeareaccompaniedbyselectiveopeningandclosing

of

differentgenes.Accondingtothese，severalgenecloningmethodweredeveloped.mRNA差異顯示技術(shù)抑制性差減雜交代表性差異分析

基因表達(dá)序列分析cDNA-AFLP技術(shù)根據(jù)真核生物成熟mRNA的多聚A尾巴設(shè)計(jì)一個(gè)錨定引物和一個(gè)隨機(jī)引物對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳分析，分理出有差異的條帶，制成探針篩選cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)，找出差異表達(dá)的基因。(1)DDRT-PCR(mRNA差異顯示)：(2)SSH（suppressionsubtractivehybridazation抑制性差減雜交）

7.3.5Homology-basedcloning

同源序列法Genessequencesarehomologybetweenplantsbelongtothesamespeciesorgenus.Soagenecanbeisolatedaccordingtothesequenceofisolatedgeneofanothercloserelativeplant.PCRmethod.從待分離植物的DNA中直接擴(kuò)增DNA片段，并與已知序列比較，確認(rèn)；Hybridizationwithgenelibrary.以已知序列的基因作探針，從待分離材料的核DNA文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中釣取同源性較高的克隆，測(cè)序并比較、確定。

7.3.6Genechip(基因芯片)Principle：Throughthecomparisonbetweendifferentspecies,orbetweendifferentindividualsofthesamespecies,orthesameindividualindifferentgrowthperiodorgeneexpressionbetweenthedifferentenvironmentalconditions。Method:采用原位合成或顯微打印手段，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNAprobe固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、并行、高效地檢測(cè)。

1）DNAmicroarrayconstructionandprinting.在序列分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)基因序列中特異的片段設(shè)計(jì)出一系列10-50bp長(zhǎng)、代表該生物所有基因或欲分離目的基因信息的DNA片段，固定在芯片上。2）Preparationoftargetsample.不同發(fā)育時(shí)期或不同處理?xiàng)l件下植物體特定器官的mRNA用熒光標(biāo)記。3）Hybridizationanddetection.通過(guò)雜交位點(diǎn)及信號(hào)強(qiáng)弱，可以得知在不同條件下各基因是否表達(dá)及表達(dá)強(qiáng)弱，進(jìn)而找出與該生理功能相關(guān)的目的基因。4）Datacollectionandanalysis(基因芯片數(shù)據(jù)的收集和分析)Produreofgenechip7.4

Gene

transferinplant

基因的遺傳轉(zhuǎn)化Plantgenetictransformation：應(yīng)用分子重組技術(shù)、細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)或種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)，有目的地將外源基因或DNA片段插入到受體植物基因組中，并使其在后代植株中得以表達(dá)的過(guò)程。7.4.1、Receptorsystem(受體系統(tǒng))Concept：是指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無(wú)性系，并能接受外源DNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。Theestablishmentofreceptorsystemispremise.(1)RequirementsforreceptorsystemingenetictransformationHighlyefficientandstableregeneration(高效穩(wěn)定的再生能力)Geneticstability(較高遺傳穩(wěn)定性)Stablesourceofexplants(穩(wěn)定的外植體來(lái)源)：無(wú)菌實(shí)生苗的子葉、胚軸、幼葉等Sensitivetoselectiveantibiotics(對(duì)選擇性抗生素敏感)EasyinfectedbyAgrobacterium(對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性)(2)Typesofreceptorsystem（1）Tissuereceptorsystem(組織受體系統(tǒng))愈傷組織再生系統(tǒng)：轉(zhuǎn)化率高，來(lái)源容易、易擴(kuò)繁、適用廣，穩(wěn)定性差，嵌合體多；直接分化再生系統(tǒng)：操作簡(jiǎn)單，無(wú)性系變異小，轉(zhuǎn)化率低，嵌合體多。（2）Protoplastreceptorsystem(原生質(zhì)體受體系統(tǒng))高效攝取外源基因、轉(zhuǎn)化準(zhǔn)確，無(wú)嵌合性，適用廣;培養(yǎng)周期長(zhǎng)，難度大，再生頻率低。（3）Germcellreceptorsystem(生殖細(xì)胞受體系統(tǒng))接受外源DNA潛能強(qiáng)，純合體便于選育，操作簡(jiǎn)便，但受季節(jié)限制。7.4.2Transformationmethod

轉(zhuǎn)化方法Directtransformethod(直接轉(zhuǎn)化法)Vectormediatedgenetransfor(載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)Germplasmsystemtransfor(種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化)①Chemicalinduction(化學(xué)誘導(dǎo)）Receptor：protoplast(原生質(zhì)體)Pricinple:PEG（聚乙二醇）可使DNA與細(xì)胞膜之間形成分子橋，促使相互間的接觸與粘連，改變細(xì)胞膜表面電荷，增加細(xì)胞膜通透性。在二價(jià)陽(yáng)離子共同作用下，使外源DNA沉積在細(xì)胞膜表面，促使細(xì)胞主動(dòng)吸收外源DNA，實(shí)現(xiàn)外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。（1）DirecttransformationofexogenousDNAprocedure：Advantage&disandvatage

Simpleoperation,lowcost,noneedexpensiveinstrument,awideplantrange,goodrepeatability,lowconversionrate：10-5~10-3外源目的基因的制備原生質(zhì)體制備目的基因與原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的鑒定和再生植株的培養(yǎng)Principle：高壓電脈沖使植物細(xì)胞膜或原生質(zhì)體上造成非對(duì)稱穿孔，每個(gè)細(xì)胞膜上形成上百個(gè)瞬間通道，允許外源基因的進(jìn)入。procedure：制備含目的基因的質(zhì)粒DNA→制備植物原生質(zhì)體懸浮液或一定處理的植物組織→混合在200~600V/cm的電場(chǎng)處理若干秒→原生質(zhì)體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化子篩選→再生植株鑒定與培養(yǎng)。②Electroporation

電穿孔法Advantage&disandvatage：Easyoperation,highconversionrate,butneedtoprotoplastculture.③Genegun(基因槍)Principle：利用火藥爆炸、高壓氣體和高壓放電作為驅(qū)動(dòng)力，將包裹有生物活性DNA的金屬小顆粒加速，高速轟擊植物組織或細(xì)胞，使外源基因?qū)崿F(xiàn)穿壁并導(dǎo)入受體細(xì)胞中，然后通過(guò)細(xì)胞核組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出新的植株類型。gunpowderHighpressure

gasgenegunAdvantage&disandvatage：unlimitedofhost,controllable,widetargetreceptors,goodrepeatability.transformatiinrateisextremelylow,costishigh,thechimericratioislarge,geneticstabilityispoor.

④Microinjection（顯微注射法）Principle：直接將外源基因注入已固定的植物細(xì)胞或組織中，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。注射部位包括子房、穗基、分蘗節(jié)等。Receptorcellsfixed：瓊脂糖包埋法，多聚L-亮氨酸粘連法，吸管支持法。Advantage&disandvatage：Controllable,hightansfornationrate,noharmtoreceptorcells,butcomplicated,time-consumingandlowworkingefficiency,morecopy,pronetomutation.（2）Vectormediatedgenetransfer

載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化Agrobacteriumtumefaciensmediatedgenetransfer（根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化）Agrobactriumrhizogenes(發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)Tumorinducingplasmid(Ti質(zhì)粒)isalargeplasmidwhichharboredinA.tumefaciensandcausecrowngallinplant.當(dāng)根癌農(nóng)桿菌感染植物時(shí)，菌體不進(jìn)入植物細(xì)胞，而僅是Ti質(zhì)粒中稱之為“T-DNA”的DNA片斷進(jìn)入寄主細(xì)胞并插入基因組中，T-DNA中的基因利用植物的酶系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。①Tiplasmid(根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒)organizationofTiplasmid（180～240kb）：T-DNAregion（與基因轉(zhuǎn)移相關(guān)），Virregion（激活T-DNA轉(zhuǎn)移），Conregion（調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌間發(fā)生結(jié)合轉(zhuǎn)移)andOriregion（調(diào)控農(nóng)桿菌自我復(fù)制)。T-DNAregionLeftborderRightborderauxincyt冠癭堿合成酶基因oriConvirVirRemould

Tiplasmid(Ti質(zhì)粒改造)Disarm:刪除T-DNA左右邊界中的onc（激素合成）基因，構(gòu)建卸甲載體。Addselectivemarker:引入大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記。Addenzymesite:插入人工多克隆位點(diǎn)。IntroducePlantgenepromoterandpoly(A):引入植物基因的啟動(dòng)子和信號(hào)序列Deletenon-essentialsequences:除去其他非必需序列?Tivectors:pGV3850,pGV2250,pTiB6S3-SE載體。Function：中間載體與卸甲載體共同組成一個(gè)植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，完成基因的轉(zhuǎn)化。Organization：

“植物特異性啟動(dòng)子+目的基因+終止子”，“植物特異性啟動(dòng)子+選擇標(biāo)記基因+終止子”。

Expressionvector(Ti中間表達(dá)載體)Cointegratevectors

(Ti共整合轉(zhuǎn)化載體)ThedisarmedTivectoriscovalentlylinkedtodonorvectorwithgeneofinterest-T-DNAbordersequencespresentinaA.tumefaciensstraintoactasoneunit.E.coli中間載體+卸甲Ti質(zhì)粒以同源重組方式整合成共合體，分子量較大，共合體的形成頻率較低，需用Southern雜交或PCR進(jìn)行檢測(cè)，構(gòu)建較困難。

CointegratedvectorbasedonPBR322homologousThevectorhaspBR322DNAintheT-DNAregion,whichprovidearegionofhomologywithmostothercloningvectors.RecombinatoninthetwoplasmidsDNAproducesthecointegrate.(在卸甲載體的T-DNA區(qū)引入PBR322，中間載體是PBR322質(zhì)?；蚱溲苌|(zhì)粒，兩者通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)目的基因及選擇性標(biāo)記基因與卸甲Ti質(zhì)粒的整合，以順式方式將基因轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中去。)基于左邊界內(nèi)部同源區(qū)（LIH）的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，即SEV系統(tǒng)。受體Ti質(zhì)粒pTiB6BS3（TL），中間載體是pMON200（TR）.含有抗性嵌合基因便于轉(zhuǎn)化植株的直接篩選。共整合載體co-integratedvectorBinaryvectors

Ti雙元轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建Concept:指由兩個(gè)分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng)。Principle：位于一個(gè)Ti質(zhì)粒上的Vir基因可以反式激活位于另一個(gè)Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移。使插入到T-DNA區(qū)的外源基因?qū)胫参锛?xì)胞中。含有廣泛寄主范圍的復(fù)制起點(diǎn)，代替了重組同源區(qū)。Binaryvector(雙元載體系統(tǒng))Transfermechanism(轉(zhuǎn)化機(jī)制)

根癌農(nóng)桿菌在自然條件下感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞中的Ti質(zhì)粒上通過(guò)特異性識(shí)別信號(hào)分子誘導(dǎo)其Vir區(qū)基因的表達(dá)，產(chǎn)生VirD1和VirD2蛋白，該2種蛋白可切割T-DNA的左右邊界，產(chǎn)生一條單鏈T-DNA分子，進(jìn)入植物細(xì)胞，并整合到植物基因組中。

Techniques：

Leaf-discmethod(葉盤法）co-culturewithprotoplast（原生質(zhì)體共培養(yǎng)）plantinfection(整株感染)Procedure：

含重組Ti質(zhì)粒的工程菌培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化；選擇合適的外植體；工程菌與外植體共培養(yǎng)；外植體脫菌及篩選；轉(zhuǎn)化植株再生及鑒定。Interestedgenestransferinto(dicotyledonous)plant

cellsAgrobacterium

mediatedtransformationAdvantage：Naturalvectorsystemwithhightransferrate,exogenousgenestransferedareoftensinglecopy,rarelymethylationandgeneticallymodifiedsilence,excellentstabilityofgene,lowcost,simpleandeasytooperate.DisadvantageHostrangelimated(雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物)，Needantibioticforalongtime(因外植體再生階段脫菌比較困難)。②A.rhizogenesmediavectors

發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的載體WhenAgrobacteriumrhizogenes(發(fā)根農(nóng)桿菌)infectplants，itcaninduceplanttoproducemanyadventitiousroots.Therootsgrowquicklyandconstantlybranchingintohairyroot,whichisinducedbyRiplasmidinfact。Noneedtodisarm.Asinglecellclonecanderivedfromhairyroot,andchimeras(嵌合體)isavoid.Ri質(zhì)?？芍苯幼鳛橹虚g載體；可與Ti質(zhì)粒配合使用建立雙元載體系統(tǒng)；Hairrootisappropriateforinvitrocultureandforproductionofsecondarymetabolites(次生代謝產(chǎn)物)。AdvartageofRiplasmidRicointegrationvectors(Ri共整合轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建)中間載體常用pBR322,pBI121等。把目的基因插入到T-DNA中，構(gòu)成中間表達(dá)載體。然后通過(guò)誘導(dǎo)菌株的協(xié)助質(zhì)粒和野生型的發(fā)根農(nóng)桿菌直接進(jìn)行三親雜交，通過(guò)同源重組把中間載體整合到Ri質(zhì)粒的T-DNA中。Ribinaryvectors(Ri雙元轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建)基本程序與Ti質(zhì)粒相同。A.rhizogenesmediatedtransformationTheprincipleandprocedureofitstransferassameasA.tumefaciensBinaryvectorsystem(3）Germplasmtransfersystem

(種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化法)①Insituvacuuminfiltrationmethod（原位真空滲入法）Procedure：將適宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過(guò)傷口感染植株，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。Advantagesanddisadvantages：Convenient,quick,reliable,lowcost,hightransferrate.Itsapplicationneedsdevelopment.②DNAtransferviapollen

(花粉管通道法)Principle：植物在雙受精完成以后，受精卵細(xì)胞的初次分裂需要充分的物質(zhì)和能量積累。該時(shí)期的細(xì)胞不具備完整的細(xì)胞壁和核膜系統(tǒng)，細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)頻繁交流。通過(guò)花粉管通道滲透進(jìn)入胚囊的外源DNA片段有可能進(jìn)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步被整合進(jìn)受體植物基因組中。③Seedsoakingmethod

(種子浸泡法)Principle：Usingplantcellsmaterialtransportationsystem,exogenousDNAisdirectlytransforedintoreceptorcells.通過(guò)細(xì)胞間隙與胞間連絲組成的網(wǎng)絡(luò)化運(yùn)輸系統(tǒng)將外源DNA運(yùn)至每個(gè)細(xì)胞。通過(guò)內(nèi)吞作用將外源DNA攝入細(xì)胞。7.5IdentificationofgenetransformationplantReporterorselectablegenes(利用選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因)RecombinantDNA(利用重組DNA分子鑒定)Transcriptionorexpressionofexogenousgene(利用外源基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)鑒定)7.5.1

Selectablegenes

選擇標(biāo)記基因Antibioticresistancemarker：nptⅡ(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)，hpt(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)，Herbicideresistancemarker：Bargene(草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶）Antimetabolitemarker（抗代謝物標(biāo)記基因）：dhfr(二氫葉酸還原酶基因)7.5.2Reportergene

報(bào)告基因Opinesynthase(冠癭堿合成酶基因)：檢測(cè)冠癭堿Chloramphenicolacetyltransferase(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因,cat)：放射性檢測(cè)β-galactosidase(半乳糖苷酶基因,GUS):藍(lán)色Greenfluorescentprotein(,綠色熒光蛋白,GFP)：綠色熒光Anthocyanins(花青素合成相關(guān)基因)(C1,B/R):紅色斑點(diǎn)7.5.3

RecombinantDNAcharacteristic

利用重組DNA分子特征的鑒定Enzymedigestionprofile(DNA分子酶切圖譜鑒定)PCR鑒定Southern雜交7.5.4

Transcriptionorexpressionofexogenousgene

利用外源基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)鑒定NorthernblottingWestern

blottingProteinimmunoassay(蛋白免疫測(cè)定)7.6Strategytoimprovetheexogenousgeneexpression提高外源基因的表達(dá)水平7.6.1Transgenesilencing

轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象Transgenesilencing（轉(zhuǎn)基因沉默）:導(dǎo)入并整合進(jìn)受體基因組中的外源基因在轉(zhuǎn)化體的當(dāng)代或其后代出現(xiàn)表達(dá)收到抑制，甚至完全不表達(dá)的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因在受體植物中往往不能穩(wěn)定表達(dá)，有時(shí)甚至完全不表達(dá)的現(xiàn)象。Types:Transcriptionalgenesilencing(轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默)Post-transcriptionalgenesilencing(轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默)7.6.2Thecauseforgenesilencing

引發(fā)基因沉默的原因DNAmethylation(DNA甲基化)Repeatinduced(重復(fù)序列誘導(dǎo)）Positioneffect(位置效應(yīng)):異染色質(zhì)區(qū)co-suppression(共抑制現(xiàn)象)：RNAinterference（RNAi）Example:CHS(苯基苯乙烯酮合成酶)轉(zhuǎn)化矮牽牛AntisenseRNA(反義RNA)7.6.3Strategytoimprovetheexogenousgeneexpression

提高外源基因表達(dá)的策略采用合適的轉(zhuǎn)化方法：Agrobacteriummediatedtransfer使用信號(hào)肽使用強(qiáng)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和強(qiáng)終止子使用增強(qiáng)子使用植物偏愛(ài)密碼子防止甲基化改造外源基因使用基質(zhì)結(jié)合序列7.7Thetransgenicplantssafetymanagement

轉(zhuǎn)基因植物安全性管理7.7.1Transgenicplantfoodsafety

轉(zhuǎn)基因植物食品安全性(1)Transgenicfood：表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因生物體直接作為食品或以其為原料加工生產(chǎn)的食品就是轉(zhuǎn)基因食品。SubstantialEquivalence(實(shí)質(zhì)等同性原則):Theorganizationforeconomiccooperationanddevelopmentproposedin1993.Including：

1）Phenotypicequivalent(表型等同)

2）Compositionequivalent(成分等同)

如果轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品具有實(shí)質(zhì)等同性，則可以認(rèn)為是安全的。(2)Evaluationprincipleforsafetyofgeneticallymodifiedfood

轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)原則Toxicsubstances:必須確保轉(zhuǎn)入外源基因或基因產(chǎn)物對(duì)人畜無(wú)毒。Anaphylaxis(過(guò)敏反應(yīng)):在自然條件下存在著許多過(guò)敏源。Nutrition(營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題)Resistancetoantibiotics(對(duì)抗生素的抵抗作用)

(3)T