實驗一凝集試驗

實驗一

凝集試驗

目的要求:

1、掌握玻片凝集試驗和試管凝集試驗的操作技術。

2、掌握凝集反應中陰陽性結果的判定。

凝集試驗：抗原與相應抗體結合，在電解質存在下，經過一定時間，形成肉眼可見的凝集團塊，稱為凝集試驗（agglutinationtest，agg）反應中的抗原——凝集原抗體——凝集素

凝集試驗的類型：直接凝集試驗間接凝集試驗協同凝集試驗橋梁凝集反應病毒的血凝和血凝抑制試驗一、直接凝集試驗

細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結合并出現凝集現象稱直接凝集試驗(directagglutinationtest)。按操作方法分玻片法和試管法兩種。（一）試管凝集試驗

實驗材料:

1、布氏桿菌試管凝集抗原

由獸醫(yī)生物藥品廠生產供應。該抗原為布氏桿菌死菌混懸液，每1ml約含菌100億。是將牛型、羊型、豬型三型布氏桿菌的培養(yǎng)物殺死，懸浮于0.5%的石炭酸生理鹽水中制成。靜置時上層清亮無色或略呈灰白色，瓶底有菌體沉淀。用時需充分搖勻，并用0.5%的石炭酸生理鹽水按規(guī)定倍數稀釋（1：20）。

2、布氏桿菌病待檢血清

從被檢動物采取。被檢血清必須新鮮、無明顯蛋白凝塊、無溶血現象和腐敗氣味，采血后不得遲于2～3d檢驗。否則需加防腐劑或冰凍保存。

3、布氏桿菌陽性血清

由獸醫(yī)生物藥品廠生產供應。通常取自人工免疫的家畜，也可從送檢血清中選取。其凝集價不能低于1：800。

4、布氏桿菌陰性血清由獸醫(yī)生物藥品廠生產供應。

5、0.5％石炭酸生理鹽水自配

實驗方法與步驟:

（一）布氏桿菌試管凝集試驗按下表術式加樣操作。布氏桿菌試管凝集試驗術式表

管號1234567最終血清稀釋度1:251:501:1001:200對照

抗原陽性血清陰性血清

1:201:251:250.5%石炭酸生理鹽水（ml）被檢血清（ml）

2.30.50.5

0.50.20.50.5

0.5

棄1.5棄0.5

0.5－

－

－

0.50.51:20抗原（ml）0.5

0.50.50.50.50.50.5混勻，37C溫箱4～l0h，取出后置室溫18～24h，觀察并記錄結果結果﹟+++

++

－

－﹟－

加樣：①每份血清用4支試管，另取對照試管3支，置試管架上。②按上表在各管中先加0.5％石炭酸生理鹽水。③以1ml吸管吸取待檢血清0.2ml，加入第1管中，充分混勻，吸出1.5ml棄之，再吸出0.5ml

加入第2管，混勻后吸出0.5ml加入第3管，依此類推至第4管，混勻后棄去0.5ml。④第6管中加1:25稀釋的布氏桿菌陽性血清0.5ml⑤第7管中加1:25稀釋的布氏桿菌陰性血清0.5ml⑥每管各加以0.5％石炭酸生理鹽水稀釋20倍的布氏桿菌試管凝集抗原0.5ml。

作用：在各試管加完抗原后，將7支試管同時充分混勻，置37℃培養(yǎng)箱中4～l0h，取出后置室溫18～24h，然后觀察并記錄結果。

結果記錄：

﹟：液體完全透明，菌體完全被凝集呈傘狀沉于管底，振蕩時，沉淀物呈片狀、塊狀或顆粒狀（即100％的菌體被凝集）

+++

液體略呈混濁，菌體大部分被凝集沉于管底，振蕩時情況如上（75％菌體被凝集）。

++

液體不甚透明，管底有明顯的凝集沉淀，振蕩時有塊狀或小片絮狀物（50％凝集）

+

液體透明度不明顯或不透明，有不甚顯著的沉淀或僅有沉淀的痕跡（25％菌體被凝集）

－：液體不透明，管底無凝集，有時管底可見有一部分沉淀，但振蕩后立即散開呈均勻混勻

確定被檢血清凝集價（滴度）：

以出現“++”以上凝集現象的血清最高稀釋度為終點。布病判定標準：

陽性：牛、馬和駱駝凝集價1:100以上豬、綿羊、山羊和狗1:50以上可疑：牛、馬和駱駝1:50

豬、羊等1:25待檢血清稀釋度：豬、羊、狗

1:25，1:50，1:100，1:200

牛、馬、駝

1:50，1:100，1:200，1:400

大規(guī)模檢疫可只用兩個稀釋度。豬、羊、狗1:25和1:50

牛、馬、駝1:50和1:100

（二）玻片凝集試驗材料：

1、布氏桿菌玻片凝集反應抗原

2、布氏桿菌病待檢血清

3、布氏桿菌陽性血清

4、布氏桿菌陰性血清方法與步驟：①取潔凈載玻片一塊，中間滴1滴布氏桿菌待檢血清；另取載玻片一塊，左側滴1滴布氏桿菌陽性血清，右側滴1滴布氏