相應(yīng)面法提取工藝分析

響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取夏枯草總黃酮的工藝研究

開題報(bào)告人：王玲燕指導(dǎo)老師：葛立軍班級：藥學(xué)專升本（2）班目錄一二三六

五四選題依據(jù)和目標(biāo)研究技術(shù)路線研究方案課題關(guān)鍵及難點(diǎn)完成該課題已具備的條件參考文獻(xiàn)

七研究進(jìn)度安排一.選題依據(jù)和目標(biāo)

背景：夏枯草PrunellavulgarisL，別名：麥穗夏枯草、鐵線夏枯草等。唇形科，夏枯草屬。多年生草本植物,廣泛分布于我國河南、安徽、江蘇等省。夏枯草含有蕓香苷、金絲桃苷等黃酮類成分。具有清肝明目、活血化瘀及抗癌、抗氧化等作用。研究內(nèi)容：本課題以夏枯草黃酮為研究對象，采用響應(yīng)面優(yōu)化酶法，以夏枯草黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析(RSM)，得出夏枯草黃酮提取的最佳工藝條件。意義：酶法提取夏枯草黃酮的工藝較好,所得的黃酮得率較高,為以后的工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。夏枯草單因素試驗(yàn)溫度PH酶解時(shí)間Box-Behnken的中心組合原理工藝流程酶處理粗提物工藝條件加酶量響應(yīng)面試驗(yàn)Design-Expert軟件三.課題關(guān)鍵問題及難點(diǎn)1.關(guān)鍵問題纖維素酶解是本課題的關(guān)鍵用纖維素酶使其細(xì)胞壁破裂，并使其黃酮類成分溶出完全，提高黃酮得率。因?yàn)槊妇哂袑Ｒ恍裕饔脳l件較溫和等特點(diǎn)。2.難點(diǎn)響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化是本課題的難點(diǎn)。首先必須通過大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立一個(gè)合適的數(shù)學(xué)模型，然后再用此數(shù)學(xué)模型作圖，如何獲取誤差范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)。四、研究已具備的條件1.前期籌備了大量研究所需資料，及查閱了豐富相關(guān)的文獻(xiàn)。2.

掌握了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技能。3.所需儀器，包括離心機(jī)、搖床、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、水浴箱、電子天平等。4.蘆丁、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、石油醚、硫酸亞鐵、纖維素酶

5.經(jīng)費(fèi)充足研究工作基礎(chǔ)所需儀器和設(shè)備所需試劑經(jīng)費(fèi)情況五、研究方案5.1最大吸收波長選擇和標(biāo)準(zhǔn)曲線制備稱取適量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇溶解后，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，振蕩搖勻，放置6min；再加入10%硝酸鋁0.3mL，振蕩搖勻，放置6min；最后加入4%氫氧化鈉試液4mL，加乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min。在紫外分光光度計(jì)200-800nm處進(jìn)行波長掃描，測定最大吸收波長。精密稱取蘆丁對照品1mg置50mL容量瓶中，加適量乙醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻備用。量取對照品溶液0，1，2，3，4，5mL，分別置10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，振蕩搖勻，放置6min；再加入10%硝酸鋁0.3mL，振蕩搖勻，放置6min；最后加入4%氫氧化鈉試液4mL，加乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min。采用分光光度法，在最大吸收波長處測定吸光度，以對照品量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.最大吸收波長的選擇2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備五、研究方案5.2總黃酮提取方法和其含量測定準(zhǔn)確稱取5.00g夏枯草，用纖維素酶預(yù)處理，酶解后滅活，并離心。然后加入一定體積某濃度的乙醇，在一定溫度下加熱回流一定的時(shí)間，過濾。棄去濾渣，測量并記錄濾液體積V，得到夏枯草總黃酮的乙醇溶液，即待測液。取0.5mL待測液，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL振蕩搖勻，放置6min后加入10%硝酸鋁溶液0.3mL振蕩搖勻，放置6min后加入4%氫氧化鈉溶液4mL，加乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，用分光光度法在510nm測定吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得總黃酮含量?？傸S酮提取總黃酮含量五、研究方案（1）酶的種類對夏枯草黃酮得率的影響（2）加酶量對夏枯草黃酮得率的影響（3）

pH值對夏枯草黃酮得率的影響（4）酶解溫度對夏枯草黃酮得率的影響（5）酶解時(shí)間對夏枯草黃酮得率的影響5.3單因素試驗(yàn)表6-1酶的種類對黃酮提取率的影響酶的種類纖維素酶果膠酶蛋白酶空白對照(醇提)黃酮得率(%)表6-2加酶量對黃酮提取率的影響加酶量U/ml1234黃酮得率(%)表6-3PH對黃酮提取率的影響PH3.54.04.555.5黃酮得率(%)表6-4酶解溫度對黃酮提取率的影響酶解溫度(℃)4045505560黃酮得率(%)表6-5酶解時(shí)間對黃酮提取率的影響酶解時(shí)間11.522.53黃酮得率(%)五、研究方案5.4響應(yīng)面試驗(yàn)系統(tǒng)考察酶解法的工藝參數(shù)，根據(jù)已有的資料及實(shí)際情況，選用加酶量（X1），酶解溫度（X2），pH（X3），酶解時(shí)間（X4），作為考察因素，具體參數(shù)詳見因素水平表（表1），以測得的浸提取樣品中總黃酮含量為考察指標(biāo)，選用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)表（表3）提取，得到相應(yīng)供試液。表6-6因素水平水平因素X1加酶量(U/ml)X2酶解溫度(℃)X3pHX4酶解時(shí)間(h)-114541.502504.52135552.5表6-7響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)表試驗(yàn)X1加酶量(U/ml)X2酶解溫度(℃)X3pHX4酶解時(shí)間(h)黃酮得率(%)1-1-1002-110031-10041100500-1-1600-117001-1800119-100-110-100111100-1121001130-1-10140-1101501-1016011017-10-1018-10101910-10201010210-10-1220-10123010-12401012500002600002700002014.12—2015.04查找資料，文獻(xiàn)綜述2015.04—2015.05開題報(bào)告，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備2015.05—2015.09完成實(shí)驗(yàn)，整理數(shù)據(jù)2015.09—2015.11撰寫論文，論文答辯六.研究進(jìn)度安排

1.王蘭,趙麟.響應(yīng)面分析法優(yōu)化柿葉總黃酮提取工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2011(03).2.于敬,周晶.生物酶解技術(shù)在中藥提取中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2010,25(5):340-344.3.薛明，馮怡，徐德生．夏枯草化學(xué)成分及藥理作用的研究概況[J]．江蘇中藥，2005，26(5)：55--56．4.