芯片技術(shù)-徐翔麗課件

生物芯片技術(shù)S11111049生物芯片是指通過機(jī)器人自動打印或光引導(dǎo)化學(xué)合成技術(shù)在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的高密度的組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸、糖類以及其它生物組分的微點(diǎn)陣。芯片與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號即可實(shí)現(xiàn)對生物樣品的分析?；蛐酒鞍踪|(zhì)芯片芯片實(shí)驗(yàn)室相對于DNA芯片,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)面臨更多困難。第一,相對于DNA的堿基配對雜交機(jī)制,蛋白質(zhì)之間的相互作用呈現(xiàn)出更強(qiáng)的變化性。而且,蛋白質(zhì)的活性以及相互作用的性質(zhì)可能需要其它蛋白質(zhì)的作用和翻譯后修飾。第二,相對于PCR技術(shù)這樣可以大量擴(kuò)增DNA的技術(shù),尚未有可以大量擴(kuò)增蛋白質(zhì)的成熟技術(shù)。第三,蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化工作十分艱巨,而且經(jīng)常不能保持蛋白質(zhì)的完整功能。最后,許多蛋白質(zhì)很不穩(wěn)定,給陣列制作本身帶來很大的困難蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物,接近生命活動的物質(zhì)層面；探針蛋白特異性高、親和力強(qiáng),可簡化樣品前處理，甚至可直接利用生物材料(血樣、尿樣、細(xì)胞及組織等)進(jìn)行檢測；適合高通量篩選與靶蛋白作用的化合物；有助于了解藥物或毒物與其效應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用。研究蛋白質(zhì)芯片的意義蛋白質(zhì)芯片的分類一、按制作方法和用途分類蛋白質(zhì)檢測芯片主要包括抗體芯片、抗原芯片、配體芯片、碳水化合物芯片等。它是將具有高度親和特異性的探針分子(如單克隆抗體)固定在基片上,用以識別復(fù)雜生物樣品溶液(如細(xì)胞提取物)中的目標(biāo)多肽,當(dāng)放射性同位素或熒光標(biāo)記的靶分子與芯片上的探針分子結(jié)合后,通過激光共聚焦掃描或電荷耦合檢測裝置(CCD)對信號的強(qiáng)度進(jìn)行檢測,從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。蛋白質(zhì)功能芯片它是將所研究體系中的每種天然蛋白質(zhì)點(diǎn)加在基片上制成芯片，用于天然蛋白質(zhì)活性及分子親和性的高通量平行研究。要了解體系中有哪些蛋白質(zhì)能與蛋白質(zhì)結(jié)合,則將制成的蛋白質(zhì)功能芯片與熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)溫育,經(jīng)熒光顯微鏡掃描檢測可知,芯片上的亮點(diǎn)即為蛋白質(zhì)的潛在結(jié)合物。蛋白質(zhì)功能芯片主要用來檢測蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。Quantitativeanalysisofhumanserumleptinusingananoarrayproteinchipbasedonsingle-moleculesandwichimmunoassayTalanta78(2009)608–612Wereportamethodforthequantitativeanalysisofhumanserumleptin,whichisaproteinhormoneasso-ciatedwithobesity,usingananoarrayproteinchipbasedonasingle-moleculesandwichimmunoassay.Thenanoarraypatterningofabiotin-probewithaspotdiameterof150nmonaself-assembledmono-layer

functionalizedbyMPTMSonaglasssubstratewassuccessfullyaccomplishedusingatomicforcemicroscopy(AFM)-baseddip-pennanolithography(DPN).Unlabeledleptinproteinmoleculesinhumanserumweredetectedbasedonthesandwich

fluorescenceimmunoassaybytotalinternalreflectionfluorescencemicroscopy(TIRFM).Thelinearregressionequationforleptinintherangeof100zM–400aMwasdeterminedtobey=456.35x+80,382(R=0.9901).Theaccuracyandsensitivityofthechipassaywereclinicallyvalidatedbycomparingtheleptinlevelinadultserumobtainedbythismethodwiththosemeasuredusingtheenzyme-linked

immunosorbentassay(ELISA)performedwiththesameleptinstan-dardsandserum

samples.IncontrasttoconventionalELISAtechniques,theproposedchipmethodologyexhibitedtheadvantagesofultra-sensitivity,asmallersamplevolumeandfasteranalysistime.目前應(yīng)經(jīng)廣泛應(yīng)用的測定人類瘦蛋白的方法thecapillaryelectrophoresis（毛細(xì)管電泳)

immunofunctionalassay（細(xì)胞免疫功能檢測）ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）radioimmunoassay（放射免疫檢定發(fā)）Westernblottingtechniques（印跡）Althoughtheyarereliable,thesemethodsarerelativelyexpensiveandarerestrictedtothedeterminationofsingletargetspecificity.Theleptinproteinnanoarraysformedviaatomicforcemicroscopy(AFM)-baseddip-pennanolithography(DPN)weredetectedusingatotalinternalreflectionfluorescencemicroscopy(TIRFM)systematthesingle-moleculelevelbasedonasingle-moleculesandwichfluorescenceimmunoassay.

Inthenanoarrayleptinproteinchipbasedonthesingle-moleculesandwichfluorescenceimmunoassay,thefluorescenceintensityofthearrayspotwasproportionaltotheantigenconcentration(Fig.3).Thisresultdemonstratedthepotentialapplicationofsingle-molecule,sandwich-type,antibodynanoarraysforthedetectionofindividualproteinmoleculemarkersatthesingle-moleculelevel.Arepresentativecalibrationcurvebasedontheplotofthespotfluorescenceintensityagainstthehumanleptinstandardintherangeofconcentrationsof100zM–7.8pMusingthenanoarrayproteinchipandTIRFMisshowninFig.4A.Thelinearrangewas100zM–400aM(correla-tioncoefficient,R=0.9901)intheassayofthenanoarrayproteinchip(Fig.4B).Thespotintensityvalueswerecalculatedafterback-groundsubtractions.TheLODoftheleptinproteinwas100zMinthenanoarrayleptinproteinchipassay.ComparisonofELISAandnanoarrayproteinchip說明納米陣列蛋白質(zhì)芯片與酶聯(lián)免疫吸附測定相比具有更低的檢測限，需要更少的樣品量和檢測時(shí)間。說明在