凝膠色譜、親和色譜研究進(jìn)展及案例課件

主講人：

CollegeofFoodScience,SCAU修德博學(xué)求實(shí)創(chuàng)新凝膠、親和色譜目錄近期中國(guó)色譜研究進(jìn)展中國(guó)色譜研究進(jìn)展中國(guó)色譜最新動(dòng)態(tài)凝膠、親和色譜案例分析凝膠過濾色譜親和色譜一、近期中國(guó)色譜研究進(jìn)展文章名：《近年中國(guó)色譜研究進(jìn)展》作者：張祥民1、張麗華2、張玉奎2（2003年院士）作者單位：1.復(fù)旦大學(xué)2.中科院大連化物所發(fā)表期刊：《色譜》發(fā)表時(shí)間：2012年文章名：《近期色譜研究的最新動(dòng)態(tài)和進(jìn)展》作者：白泉作者單位：西北大學(xué)發(fā)表期刊：《色譜》發(fā)表時(shí)間：2015年色譜方法應(yīng)用于化學(xué)領(lǐng)域的論文數(shù)量占46%，生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域的占21%，食品科學(xué)與技術(shù)領(lǐng)域的占5%，材料科學(xué)、工程學(xué)、微生物學(xué)領(lǐng)域的各占4%，環(huán)境科學(xué)、光譜學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域的各占3%，上述領(lǐng)域之外的論文比例為8%。1990年至2010年，中國(guó)科學(xué)家所發(fā)表的色譜領(lǐng)域論文總數(shù)以28062篇的數(shù)量居世界第三位(第一名:美國(guó)，71008篇;第二名:日本，35035篇)。2010年發(fā)表論文4146篇，2011年發(fā)表4574篇，排名躍居世界第一。

涉及毛細(xì)管電泳（CE）、氣象色譜（GC）高效液相色譜（HPLC）論文增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)2、最新動(dòng)態(tài)樣品前處理膜蛋白的疏水性強(qiáng)、溶解性差和豐度低，對(duì)它的分離分析是蛋白質(zhì)組學(xué)中的一大難題。復(fù)旦大學(xué)的劉寶紅教授課題組采用殼聚糖改性的介孔泡沫石墨烯(MGF-CS)作為納米反應(yīng)器，從有機(jī)溶劑中高效富集疏水性膜蛋白并進(jìn)行原位酶解。將該技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際樣品中膜蛋白的分析鑒定，采用二維液相色譜－質(zhì)譜方法(2D-LC-MS)可鑒定931種膜蛋白，而通常采用的水溶液中酶解法僅能鑒定73種膜蛋白。結(jié)果表明多功能的MGF-CS對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)中膜蛋白的分析鑒定具有重要的應(yīng)用價(jià)值。分子印跡技術(shù)是采用人工合成方法制備對(duì)目標(biāo)分子有特異性識(shí)別材料的技術(shù)。由于蛋白質(zhì)體積大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、易于變性，完整蛋白質(zhì)模板分子難以獲得且價(jià)格昂貴，因此限制了蛋白質(zhì)分子印跡材料的發(fā)展。中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所張麗華研究員課題組提出了一種蛋白質(zhì)抗原決定基分子印跡磁性納米材料的制備新方法。抗原決定基印跡是以目標(biāo)蛋白質(zhì)上一段特異性多肽為模板分子進(jìn)行印跡。由于模板肽段與目標(biāo)蛋白質(zhì)間存在極強(qiáng)的特異性，形成的印跡位點(diǎn)對(duì)模板肽段及目標(biāo)蛋白質(zhì)均具有特異性識(shí)別能力。金屬有機(jī)骨架化合物（MOFs）因具有比表面積大、結(jié)構(gòu)多樣性、孔道尺寸可調(diào)、骨架可修飾、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于分離分析等領(lǐng)域。西班牙BalearicIslands大學(xué)的

Palomino課題組利用注射器設(shè)計(jì)了一種針管式自動(dòng)磁性（MOFs）分散固相微萃取裝置。固定相多孔整體材料作為一種新型分離介質(zhì)，由于其具有制備簡(jiǎn)便、通透性好、性能穩(wěn)定和易于修飾等特點(diǎn)而被譽(yù)為第四代色譜分離介質(zhì)。鄒漢法課題組發(fā)展了一種基于光引發(fā)巰基－丙烯酸酯點(diǎn)擊聚合反應(yīng)的新方法，并成功制備了具有高分離性能的有機(jī)－硅膠雜化整體柱。與巰基－烯和巰基－甲基丙烯酸酯點(diǎn)擊聚合反應(yīng)相似，光引發(fā)的巰基－丙烯酸酯點(diǎn)擊聚合反應(yīng)不僅反應(yīng)效率較高，速度快，而且反應(yīng)條件非常溫和。加拿大卡爾加里大學(xué)的Thurbide小組將316不銹鋼粉末（粒徑44~149μm）填充于316不銹鋼毛細(xì)管柱內(nèi)作為支持體，將水泵入色譜柱中，建立了以水為固定相，CO2為流動(dòng)相，與火焰離子化檢測(cè)器聯(lián)用的超臨界流體色譜分離體系（SFC-FID）。二、凝膠、親和色譜案例分析1、凝膠過濾色譜（凝膠色譜分為凝膠過濾色譜和凝膠滲透色譜）文章名：《凝膠過濾色譜法測(cè)定嬰兒配方乳粉中α-乳白蛋白》作者：賈云虹，宋曉青，楊凱作者單位：河北省三元食品有限公司發(fā)表期刊：《食品科技》發(fā)表時(shí)間：2015年《食品科技》（FoodScienceandTechnology）1975年創(chuàng)刊，北京市糧食科學(xué)研究所主辦，1996-2011年連續(xù)5屆中文核心期刊。背景α-乳白蛋白中富含色氨酸，色氨酸是人體必需氨基酸之一。食用α-乳白蛋白和食用酪蛋白的結(jié)果相比，大腦中的色氨酸含量比例高達(dá)48%，且減弱了中性氨基酸和色氨酸在穿過血腦屏障時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)。這些依據(jù)表明，在嬰兒配方乳粉中加入富含色氨酸的α-乳白蛋白，使其接近母乳中α-乳白蛋白的含量比例，是非常必要的。牛乳母乳80%酪蛋白+20%乳清蛋白60%乳清蛋白α-乳白蛋白濃度1.0~1.5g/L，占清蛋白的20%α-乳白蛋白是母乳清蛋白的主要成分，在成熟母乳中(30d后)的濃度為(2.44±0.64)g/Lα-乳白蛋白檢測(cè)方法方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)普適性最強(qiáng)操作復(fù)雜，測(cè)定周期長(zhǎng)，重現(xiàn)性差，只能半定量。反相高效液相色譜(RP-HPLC)快速高效精準(zhǔn)、重現(xiàn)性穩(wěn)定只能檢測(cè)出天然的α-乳白蛋白離子交換液相色譜(FPLC)快速高效精準(zhǔn)需要預(yù)先把要乳清蛋白與酪蛋白分離才可以進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)定量分析可靠蛋白質(zhì)容易在石英毛細(xì)管上吸附，影響分離效率，甚至堵塞毛細(xì)管柱液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)靈敏度高、穩(wěn)定性好只能檢測(cè)非變性的α-乳白蛋白實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確稱取含有大約相當(dāng)于10mg蛋白質(zhì)的樣品，樣品溶在盛有流動(dòng)相溶液的10mL容量瓶中，超聲處理30min。從以上樣品中轉(zhuǎn)移1.5mL于10mL離心管中，加入10μLβ-硫基乙醇，搖動(dòng)混合約10s，讓樣品在室溫下放置至少2h，用0.45μm微孔濾膜過濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中，然后注射進(jìn)液相色譜。根據(jù)標(biāo)樣峰面積和濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算樣品中α-乳白蛋白含量。選擇色譜柱α-乳白蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為14200u，而凝膠色譜柱TSK-2000SWXL分離樣品的相對(duì)分子質(zhì)量范圍為5000~150000u，因此選擇此色譜柱是比較合適的。組成蛋白質(zhì)的氨基酸在210~280nm范圍內(nèi)都有不同程度的吸收，但只有色氨酸在280nm有足夠高的吸收，而α-乳白蛋白含有豐富的色氨酸，因此選擇280nm作為DAD的檢測(cè)波長(zhǎng)，能獲得較好的靈敏度?；貧w方程和檢出限稱取適量α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相配制成0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，按照1.3所述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到α-乳白蛋白線性回歸方程：Y=8407.6X-90.26，線性相關(guān)系數(shù)：R2=0.9998。以信噪比S/N=3計(jì)算α-乳白蛋白的檢測(cè)限為2.8μg/mL，完全能滿足嬰兒配方乳粉中α-乳白蛋白含量的測(cè)定。嬰兒配方乳粉中α-乳白蛋白含量的測(cè)定2、親和色譜文章名：《親和色譜應(yīng)用于天然活性成分篩選的研究進(jìn)展》作者：馮穎淑1，童珊珊2，徐希明2等作者單位：1中國(guó)藥科大學(xué)2江蘇大學(xué)發(fā)表期刊：《中國(guó)中藥雜志》發(fā)表時(shí)間：2015年親和色譜法篩選技術(shù)受體為親和配基的色譜篩選酶為親和配基的色譜篩選血漿蛋白為親和配基的色譜篩選以DNA為親和配基的色譜篩選細(xì)胞膜色譜篩選脂筏色譜篩選分子印跡技術(shù)其他親和配基（如核酸適配體親和色譜、免疫親和色譜、金屬離子親和色譜等等。）文章名：《殼聚糖螯合凝膠層析法純化血液超氧化物歧化酶》作者：王保，全平娟，張永州等作者單位：河南大學(xué)，中科院生物物理研究所，蘭州大學(xué)發(fā)表期刊：《食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)》發(fā)表時(shí)間：2014年研究背景超氧化物歧化酶簡(jiǎn)稱SOD，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種可防止氧化損傷和缺失的活性酶，也是一種應(yīng)用廣泛的藥用酶，具有抗衰老、預(yù)防輻射及治療炎癥等一系列功能，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)。1975年proath首次提出固定化金屬螯合親和層析（IMAC），利用固定在基質(zhì)上的過渡態(tài)金屬離子和蛋白質(zhì)表面的組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等殘基的配位作用，來實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬離子有親和力的蛋白質(zhì)的吸附和分離。在制備親和介質(zhì)時(shí)，常用的金屬離子有Cu2+，Zn2+和Ni2+等，常用的螯合配基有亞氨基二乙酸（IDA），三羧基甲基乙二胺（TED），次氨基三乙酸（NTA）等。固定化螯合親和色譜常常以凝膠為載體，如在SephadexG-75或者DEAE-superpose等凝膠上用化學(xué)交聯(lián)方法引入螯合劑IDA，再通過交聯(lián)固定和親和配（Ba2+，Cu2+，Zn2+）。用該方法制備的凝膠介質(zhì)生產(chǎn)成本很高，軟基質(zhì)很易被壓縮，不易被放大生產(chǎn)。近年來，隨著基因工程下游技術(shù)的發(fā)展，基因重組蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)越來越顯示其重要性，金屬螯合層析技術(shù)（IMAC）分辨率高、選擇性好，能在常規(guī)的變性條件下及非變性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)組分分離純化。