流式細(xì)胞儀使用一般方法及技巧教學(xué)資料

流式細(xì)胞儀標(biāo)本(biāoběn)處理一般原則及方法流式細(xì)胞儀使用(shǐyòng)一般方法及技巧臨床流式細(xì)胞儀應(yīng)用(yìngyòng)簡介殷躍鋒流式細(xì)胞儀原理介紹第一頁，共98頁。雙光源(guāngyuán)系統(tǒng)流式細(xì)胞儀第二頁，共98頁。第三頁，共98頁。在管道大約50倍直徑距離處，鞘液中心(zhōngxīn)速度與邊緣速度達(dá)到穩(wěn)定，形成穩(wěn)定的層流。樣本與鞘液未入管道時(shí)，邊緣與中心速度(sùdù)一致。進(jìn)入管道后，受管壁(ɡuǎnbì)粘性阻力邊緣速度下降，中心速度不變。流體形成層流后，會產(chǎn)生流體聚焦效應(yīng)，所有顆粒均被推致流速最快的液流中。顆粒以衡定的速度作勻速運(yùn)動。第四頁，共98頁。無論每秒檢測數(shù)量為多少(duōshǎo)，顆粒經(jīng)過檢測區(qū)的速度是衡定的第五頁，共98頁。第六頁，共98頁。流式細(xì)胞儀標(biāo)本準(zhǔn)備染色(rǎnsè)的一般原則及方法第七頁，共98頁。標(biāo)本來源(láiyuán)：外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細(xì)胞、脫落細(xì)胞及其他。根據(jù)各種具體實(shí)驗(yàn)，選用不同(bùtónɡ)的抗凝劑?？捎玫目鼓齽┤缦拢篍DTA：2mg/ml枸椽酸鈉：0.38%肝素(ɡānsù)：15IU/ml第八頁，共98頁。標(biāo)本(biāoběn)處理時(shí)間：新鮮樣本分析(fēnxī)時(shí)，樣本采集后應(yīng)立即分析(fēnxī)樣本固定(gùdìng)方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分鐘。注：不同的實(shí)驗(yàn)，所用的固定(gùdìng)方法不完全相同。第九頁，共98頁。樣本(yàngběn)處理標(biāo)準(zhǔn)試劑：一、10%BovineSerumAlbuminBSA1.溶解(róngjiě)10gBSA至100ml蒸餾水中2.4oC，20000g離心(líxīn)30分鐘3.分裝后-20oC保存第十頁，共98頁。二、0.1%BSA-PBS緩沖液1.準(zhǔn)備(zhǔnbèi)500ml，PH7.3PBS2.加入(jiārù)5ml10%BSA3.使用(shǐyòng)0.45um濾網(wǎng)過濾三、氯化銨溶血劑1.在一升蒸餾水中溶解8.29gNH4CL,1gKHCO3和37mgNa2EDTA2.調(diào)節(jié)PH值至7.23.在使用前配置該溶血劑，并用0.45um濾膜過濾第十一頁，共98頁。方法(fāngfǎ)一：溶血法取100ul抗凝全血；2.快速加入(jiārù)2mlNH4CL溶血劑,混勻；3.室溫(shìwēn)孵育10分鐘；4.4oC，400g離心10分鐘。去上清，加入2mlBSA-PBS；5.4oC，400g離心10分鐘。去上清，加入2mlBSA-PBS；6.4oC，400g離心10分鐘。去上清，調(diào)整細(xì)胞濃度至5x106/ml。富集白細(xì)胞第十二頁，共98頁。注：化學(xué)試劑直接作用于紅細(xì)胞的溶血(rónɡxuè)劑有：以草酸為主的溶血(rónɡxuè)劑（CoulterQ-Prep），基于NH4CL的BD公司的FACSLyse溶血(rónɡxuè)劑。優(yōu)點(diǎn)：溶血時(shí)間(shíjiān)快？？？，在流式細(xì)胞儀上可清楚地將淋巴、單核、粒及紅細(xì)胞碎片相區(qū)分。缺點(diǎn)：需嚴(yán)格掌握溶血時(shí)間(shíjiān)，對白細(xì)胞表面抗原有影響，隨時(shí)間(shíjiān)細(xì)胞形態(tài)變化大。第十三頁，共98頁。方法二：密度(mìdù)離心法提取單個(gè)核細(xì)胞Histopaque1077為Ficoll與Sodiumdiatrizoate(泛影酸鈉)混合物，其密度為1.119～1.077。通過離心(líxīn)可將全血中的粒細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞分離。粒細(xì)胞沉積于1.119～1.077的血漿層，而單個(gè)核細(xì)胞則在1.077以下的血漿層中。第十四頁，共98頁。1.準(zhǔn)備(zhǔnbèi)2ml抗凝血（根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求確定用血量），等量PBS稀釋；2.準(zhǔn)備(zhǔnbèi)1mlHistopaque1077(Sigma)；3.室溫(shìwēn)下700g離心30分鐘；4.仔細(xì)將含有單個(gè)核細(xì)胞血漿層吸出；5.加4mlBSA-PBS，400g離心10分鐘；6.加2mlBSA-PBS清洗2次。操作第十五頁，共98頁。淋巴節(jié)、扁桃體、脾、胸腺等淋巴組織由于結(jié)構(gòu)松散，容易分離成單個(gè)細(xì)胞。一般(yībān)對樣本進(jìn)行切剪、研磨、過濾便可。從組織(zǔzhī)獲取淋巴細(xì)胞將樣本置于陪替氏培養(yǎng)皿，加入15mlBSA-PBS；將樣本切成3-4mm3大小，用鑷子將其分離；將樣本經(jīng)濾網(wǎng)過濾，用密度(mìdù)法分離、提純淋巴細(xì)胞。方法：第十六頁，共98頁。其他標(biāo)本：通常在其他組織中分離淋巴細(xì)胞需用(xūyònɡ)酶進(jìn)行消化。對于不同標(biāo)本，處理方法也各不相同。制備大鼠腎臟(shènzàng)浸潤細(xì)胞解剖刀、CO2孵育箱、濾網(wǎng)以及含1mg/ml膠原酶的細(xì)胞(xìbāo)培養(yǎng)液（無血清）材料：第十七頁，共98頁。方法：1.將樣本(yàngběn)置于皮氏培養(yǎng)皿，用解培刀切成小塊；2.加入10ml膠原酶溶液(róngyè)，37oCCO2培養(yǎng)箱孵育30分鐘；3.濾網(wǎng)過濾(guòl(fā)ǜ)；4.密度梯度法離心提純淋巴細(xì)胞。第十八頁，共98頁。其他(qítā)類型細(xì)胞在組織(zǔzhī)中提取細(xì)胞通常使用酶消化法。同樣對于不同組織(zǔzhī)處理方法也各異，以下是講述通用的膠原酶消化法制備組織(zǔzhī)細(xì)胞。改良后的此法尚可用于制備人、鼠上皮細(xì)胞。第十九頁，共98頁。材料

解剖刀0.15%胰蛋白酶(yídànbáiméi)Hanks’s緩沖鹽或PBS，pH7.3不含Ca、Mg離子的HBSSII型膠原酶1%BSA或5%FBS5ml的吸樣管35um尼龍濾網(wǎng)DNase第二十頁，共98頁。將樣本置于皮氏培養(yǎng)皿，加15mlBSA-PBS，將樣本切成1mm3大小，用鑷子將其分離(fēnlí)；HBSS或PBS洗清加入10ml無Ca、Mg離子0.2%II型膠原酶溶液0.02%DNase1的HBSS；37oC搖床上孵育15~60分鐘，視樣本類型而定；操作第二十一頁，共98頁。用5ml的吸樣管反復(fù)(fǎnfù)吹打，制成單個(gè)細(xì)胞懸液；使用35um濾網(wǎng)過濾，300g離心5分鐘；用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)液重懸樣本；對于某些樣本過濾后仍有小塊組織，重復(fù)第5步獲取細(xì)胞，重復(fù)第7步；用含0.15%胰酶、0.02%DNase1不含Ca、Mg的HBSS重懸，37oC孵育一段時(shí)間加入1%BSA或5%FBS，滅活酶活性。第二十二頁，共98頁。細(xì)胞培養(yǎng)許多原代細(xì)胞(xìbāo)和培養(yǎng)細(xì)胞(xìbāo)系，都為貼壁型生長。通常先用胰酶處理獲得單細(xì)胞(xìbāo)懸液，需注意消化過度會損害細(xì)胞(xìbāo)，特別是改變其表面抗原標(biāo)記。準(zhǔn)備單細(xì)胞(xìbāo)懸液1.儀器和試劑：0.25%rEDTA,pH7.20.25%的胰酶10%血清的培養(yǎng)液2.方法：a.PBS洗滌細(xì)胞(xìbāo)；b.加入0.25%有胰酶，37oC處理2~8分鐘；c.倒置顯微鏡下觀察，至大部分細(xì)胞(xìbāo)脫落懸浮后，加入含10%血清的培養(yǎng)液。d.PBS液洗滌細(xì)胞(xìbāo)，最后配成終濃度為1×106/ml的細(xì)胞(xìbāo)懸液。第二十三頁，共98頁。樣本處理第二十四頁，共98頁?？贵w(kàngtǐ)染色一般方法外周血白細(xì)胞分析(fēnxī)：100ul全血血小板分析(fēnxī)：1~5ul全血（根據(jù)樣本血小板數(shù)量）紅細(xì)胞分析(fēnxī)：1ul全血（根據(jù)樣本中紅細(xì)胞數(shù)稀釋后使用）骨髓：100ul其他樣本，計(jì)數(shù)后決定使用體積目標(biāo)(mùbiāo)細(xì)胞數(shù)量及檢測終濃度：1×106/ml第二十五頁，共98頁。細(xì)胞計(jì)數(shù)(jìshù)方法傳統(tǒng)手工計(jì)數(shù)：耗時(shí)、準(zhǔn)確度差流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)：BD，Coulter儀器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？partec儀器:最為精密的細(xì)胞計(jì)數(shù)器，直接報(bào)告(bàogào)細(xì)胞濃度第二十六頁，共98頁。反應(yīng)(fǎnyìng)體積樣本中加完抗體(kàngtǐ)后，1×106細(xì)胞反應(yīng)體積應(yīng)不小于100ul。第二十七頁，共98頁?？贵w(kàngtǐ)染色最為普通的抗體染色原則：1×106細(xì)胞對1ug抗體（抗體供應(yīng)商所推薦使用單位(dānwèi)），此濃度90%處于過飽合狀態(tài)精確使用：滴定抗體，抗體對于抗原恰達(dá)到飽合濃度第二十八頁，共98頁。SPECIFICANTIBODYNON-SPECIFICANTIBODYCONCENTRATIONAMOUNTBOUND抗體(kàngtǐ)滴定原理第二十九頁，共98頁。流式細(xì)胞儀抗體(kàngtǐ)滴定方法33μgs/n=2.51μgs/n=2.10.3μgs/n=2.40.1μgs/n=4.10.03μgs/n=4.80.01μgs/n=4.60.003μgs/n=3.50.001μgs/n=3.2auto第三十頁，共98頁。65432100102030405060DilutionSignaltoNoiseTITER第三十一頁，共98頁。孵育、溶血(rónɡxuè)、固定抗體孵育：室溫下避光15分鐘（某些情況下如：細(xì)胞內(nèi)因子檢測需冰育）溶血：如樣本含中有紅細(xì)胞需溶血（見下頁）樣本溶血后需立即上機(jī)檢測，固定(gùdìng)后可放置較長時(shí)間第三十二頁，共98頁。第三十三頁，共98頁。白細(xì)胞保護(hù)型溶血(rónɡxuè)劑Cal-Lyse(其中已含細(xì)胞固定劑)：1，100ul外周血，加入(jiārù)100ul溶血劑2，混勻后，室溫(shìwēn)下孵育10分鐘3，加入2ml蒸餾水，混勻后室溫下孵育10分鐘4，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，免洗直接上機(jī)檢測或400g離心10分鐘后PBS重懸優(yōu)點(diǎn)：試劑為溫和型溶血劑，不影響細(xì)胞表面抗原及溶血時(shí)間無需精確把握第三十四頁，共98頁。各溶血(rónɡxuè)劑性能比較第三十五頁，共98頁。第三十六頁，共98頁。第三十七頁，共98頁?？贵w標(biāo)記(biāojì)熒光素及其他熒光染料熒光激發(fā)(jīfā)及發(fā)射原理能量(néngliàng)級激發(fā)激發(fā)態(tài)發(fā)射激光能量損失第三十八頁，共98頁。標(biāo)記抗體(kàngtǐ)常用熒光素FITC激發(fā)光：488nm發(fā)射(fāshè)光：525nm;使用面最廣，價(jià)格便宜AlexaGreen具有更佳的能量轉(zhuǎn)移效率(xiàolǜ)及更純的發(fā)射光譜第三十九頁，共98頁。PE激發(fā)光488nm發(fā)射光575nm此熒光的激發(fā)效率最佳，故此熒光得到的信號最強(qiáng)檢測某些弱表達(dá)(biǎodá)的抗原，推薦使用此熒光素價(jià)格較FITC昂貴第四十頁，共98頁。PE-Cy5TC激發(fā)(jīfā)光488nm,發(fā)射光667nm為復(fù)合熒光(yíngguāng)素，熒光(yíngguāng)激發(fā)較率較高，信號強(qiáng)FTIC、PE、PE-Cy5三者為流式細(xì)胞最為常的熒光，并經(jīng)常將三者共同(gòngtóng)使用進(jìn)行三色分析第四十一頁，共98頁。PE-Cy7激發(fā)光488nm，發(fā)射光767nm為復(fù)合熒光(yíngguāng)素，2000年后被開發(fā)出來，激發(fā)效率佳與前三者聯(lián)進(jìn)可進(jìn)行單激光四色分析（488nm），光譜之間影響較小第四十二頁，共98頁。APC激發(fā)(jīfā)光633nm，發(fā)射光660在配有雙激光的流式細(xì)胞儀上，此熒光染料與FITC、PE、PE-Cy5聯(lián)用做四色分析(fēnxī)。但現(xiàn)在因單激光四色可實(shí)現(xiàn)，故使用該染料意義不大。第四十三頁，共98頁。核酸(hésuān)染料第四十四頁，共98頁。細(xì)胞膜電位(diànwèi)、離子、脂類探針現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)或開發(fā)出來了各種細(xì)胞膜電位、各類離子、pH值、脂類探針，運(yùn)用這些(zhèxiē)探針在流式細(xì)胞儀上可輕易檢測各種細(xì)胞功能，可實(shí)現(xiàn)一些異想不到的效果。詳細(xì)信息，見細(xì)胞探針公司網(wǎng)站：www.molecularP第四十五頁，共98頁。與流式細(xì)胞儀相關(guān)(xiāngguān)的熒光術(shù)語MESF（Moleculesofequivalentsolublefluorochrome）等量可溶性熒光分子：國際標(biāo)準(zhǔn)單位，用來衡量熒光強(qiáng)度自發(fā)(zìfā)熒光：細(xì)胞或顆粒在激發(fā)照射下會發(fā)出各種波長的熒光。白細(xì)胞自發(fā)(zìfā)熒光強(qiáng)度為650~1150MESF，血小板及其他顆粒自發(fā)(zìfā)熒光更低流式細(xì)胞儀精度：分析白細(xì)胞要求精度在1000MESF以內(nèi)，分析其他細(xì)胞或顆粒需要更高的精度：300MESF以內(nèi)第四十六頁，共98頁。第二(dìèr)部分流式細(xì)胞儀使用(shǐyòng)一般方法及技巧第四十七頁，共98頁。上機(jī)檢測(jiǎncè)樣本染色及溶血過程處理完后應(yīng)立即上機(jī)檢測打開流式細(xì)胞儀：預(yù)熱及進(jìn)行質(zhì)控程序選擇相應(yīng)的方案或新建方案加載或重新調(diào)節(jié)(tiáojié)各參數(shù)上樣檢測第四十八頁，共98頁。技巧一：定位(dìngwèi)目標(biāo)細(xì)胞群體尋找細(xì)胞群：如標(biāo)本為外周血，在FS/SS散點(diǎn)圖中信號最強(qiáng)的為粒細(xì)胞，依次為單核、淋巴、紅細(xì)胞碎片。要尋找淋巴細(xì)胞，可首先調(diào)低FS/SS電壓定位(dìngwèi)粒細(xì)胞后逐步調(diào)高電壓依次尋找各細(xì)胞群。使用目標(biāo)群所特有的表面標(biāo)志物結(jié)合SS信號，可最快、最特異性地定位(dìngwèi)目標(biāo)細(xì)胞群如標(biāo)本中無明顯特征細(xì)胞群，可使用已建淋巴細(xì)胞檢測方案根據(jù)相對位置定位(dìngwèi)目標(biāo)細(xì)胞群第四十九頁，共98頁。技巧二：陰性(yīnxìng)對照陰性對照作用：調(diào)節(jié)PMT電壓；設(shè)立陰、陽性界線使用抗體相應(yīng)同型熒光免疫球蛋白作為陰性對照，注對照及抗體需出自(chūzì)同一廠家（檢測一過性樣本中的某些指標(biāo)）使用對照組樣本作陰性對照（與其他實(shí)驗(yàn)中對照組含意相同，但此時(shí)仍需使陰性對照初始化儀器）對與非抗體染色，如各類核酸染料或探針：PI、ANNEXIN-V。使用空白標(biāo)本作為陰性對照，或設(shè)立陽性對照。第五十頁，共98頁。技巧(jìqiǎo)三：常見故障及解決時(shí)刻注意鞘液及廢液桶液量，熟悉儀器各類報(bào)警信號通過軟件操作儀器，很少能引起儀器硬件固障如樣本中有可見顆粒，建議過濾后再檢測如儀器經(jīng)常不使用，管道會結(jié)晶、長菌、堵塞、漏氣(lòuqì)，此時(shí)叫工程師便可解決如儀器出現(xiàn)硬件故障，通常是儀器自身問題，與操作者無關(guān)第五十一頁，共98頁。技巧(jìqiǎo)四：檢測指標(biāo)檢測前要清楚地知道：除陽性百分比指標(biāo)外，還有熒光強(qiáng)度指標(biāo)。后者往往比前者更有意義檢測時(shí)，靈活應(yīng)用放大模式：線性或?qū)?shù)（如指標(biāo)相差不大，使用線性放大，如：SS、FS；一般熒光參數(shù)使用對數(shù)放大）靈活運(yùn)用門的邏輯關(guān)系及顏色(yánsè)示蹤功能，可使檢測結(jié)果更為明了合理選擇不同的熒光素標(biāo)記試劑，以最少的投入獲取最多的信息第五十二頁，共98頁。熒光(yíngguāng)補(bǔ)償：極其重要的操作第五十三頁，共98頁。FITC與PE第五十四頁，共98頁。調(diào)與未調(diào)補(bǔ)償(bǔcháng)FL1FL2第五十五頁，共98頁。補(bǔ)償(bǔcháng)調(diào)節(jié)原理第五十六頁，共98頁。補(bǔ)償調(diào)節(jié)(tiáojié)原理第五十七頁，共98頁。雙色熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)方法：第一步IgGFITC/IgGPE通過(tōngguò)調(diào)節(jié)電壓使陰性群體落在FTIC及PE雙陰性區(qū)注在進(jìn)行調(diào)補(bǔ)償時(shí)必須將原補(bǔ)償全部歸零第五十八頁，共98頁。雙色熒光補(bǔ)償(bǔcháng)調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)方法：第二步FITC標(biāo)記(biāojì)抗體/IgGPE第五十九頁，共98頁。雙色熒光補(bǔ)償(bǔcháng)調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)方法：第三步通過(tōngguò)補(bǔ)償設(shè)置按鈕增、減補(bǔ)償百分?jǐn)?shù)第六十頁，共98頁。因?yàn)?yīnwèi)：第六十一頁，共98頁。所以(suǒyǐ)：第六十二頁，共98頁。注意(zhùyì)！用來調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)腇ITC、PE抗體必須有明顯的陽性信號，否則就不會出現(xiàn)熒光滲漏現(xiàn)像，調(diào)節(jié)補(bǔ)償也無從入手。在正式數(shù)據(jù)采集前要調(diào)整好補(bǔ)償，一旦數(shù)據(jù)被獲取，BD、Coulter儀器無法再改變補(bǔ)償partec流式細(xì)胞儀提供軟件調(diào)節(jié)補(bǔ)償技術(shù)，無論(wúlùn)何時(shí)都可重新調(diào)節(jié)多色熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)方法同雙色法第六十三頁，共98頁。復(fù)雜方案(fāngàn)分析了解流式儀胞儀各參數(shù)的意義熟悉(shúxī)設(shè)門操作開擴(kuò)思路，靈活設(shè)計(jì)各種檢測方案第六十四頁，共98頁。流式細(xì)胞儀CD34陽性干細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)方案：ISHAGE背景知識：外周血現(xiàn)已被廣泛地被用作骨髓移植癌癥患者接受大劑量化療或放療后骨髓重建造所需血干細(xì)胞HemotopoieticProgenitorCellsHPC的來源外周血源性干細(xì)胞現(xiàn)主要被運(yùn)用自體移植其應(yīng)用面也逐步拓展至異基因骨髓移植中。運(yùn)用流式細(xì)胞儀可最早監(jiān)測外周血中是否有足夠的干細(xì)胞供采集。由于(yóuyú)此類樣本中，碎片、血小板、聚集物對檢測結(jié)果影響較大，故設(shè)計(jì)了ISHAGE方案去除這些影響。第六十五頁，共98頁。CD34計(jì)數(shù)(jìshù)中的問題溶血劑：避免溶血時(shí)間過長，處理完成后將樣本置于冰水中，將降低溶血劑繼續(xù)作用的效果。另溶血后染色/染色后溶血效果各有不同。有些樣本可能存在某些特殊問題血小板可能會與CD34+或CD34-細(xì)胞(xìbāo)結(jié)合影響精確計(jì)數(shù)這個(gè)問題可通過增加EDTA來解決聚集的血小板可能會與CD34CD45抗體微弱結(jié)合但可通過巧妙的設(shè)門方案將其去除樣本保存：血小板聚集問題，細(xì)胞(xìbāo)死亡問題，凍存液如DMSO對樣本的影響抗體選擇：熒光素對抗體結(jié)合的影響陰性對照：在用CD34抗體染色的標(biāo)本中目標(biāo)細(xì)胞(xìbāo)群可能少于總細(xì)胞(xìbāo)群的0.1%而只有目標(biāo)細(xì)胞(xìbāo)群大于1%時(shí)才合適用同型作為陰性對照。需使用多參數(shù)設(shè)門來確定陰性對照收集標(biāo)本數(shù)：由于CD34+細(xì)胞(xìbāo)一般只占1%整單個(gè)核細(xì)胞(xìbāo)固可將其視作泊松分布曲線如要得到一個(gè)變異系數(shù)為10%左右值就要采集100個(gè)陽性細(xì)胞(xìbāo)。第六十六頁，共98頁。第一步一個(gè)門R1是基于CD45/SSC雙參數(shù)圖上的通過對其設(shè)門可去除紅細(xì)胞碎片和聚集物這些(zhèxiē)干擾在造血細(xì)胞樣本中尤為多見特別是在樣本使用溶血-免洗法處理后第六十七頁，共98頁。第二步將通過R1門獲取的細(xì)胞顯示在CD34/SSC雙參數(shù)點(diǎn)圖在此圖中設(shè)立R2門并調(diào)節(jié)其位置包含所有CD34強(qiáng)陽性或弱陽性的并SSC信號(xìnhào)弱及中等的細(xì)胞第六十八頁，共98頁。第三步建立一CD45/SSC雙參數(shù)點(diǎn)圖將以上CD34陽性細(xì)胞顯示(xiǎnshì)于其中在其中設(shè)門R3門去除CD34陽性顆粒中的聚集血小板淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞第六十九頁，共98頁。第四步將R3門中圈定的細(xì)胞顯示在FS/SS圖中以檢測細(xì)胞是否落在平時(shí)的幼稚淋巴細(xì)胞門R4中通過R4要去除(qùchú)比淋巴細(xì)胞小的顆粒第七十頁，共98頁。第五步如何確定R4門的位置呢？方法如下在CD45/SSC雙參數(shù)點(diǎn)圖中設(shè)立R5門圈定CD45強(qiáng)陽性且SSC低信號的淋巴細(xì)胞群體將R5門中的細(xì)胞顯示在R4門所在的FS/SS雙參數(shù)直方圖中根據(jù)其中的淋巴細(xì)胞的位置調(diào)節(jié)(tiáojié)R4門確定R4門在FS和SS軸上最小值的最低范圍第七十一頁，共98頁。第六步R1門在CD45從標(biāo)的下限則根據(jù)以下直方圖來確認(rèn)建立第5張CD45/CD34雙參數(shù)直方圖根據(jù)CD34陽性顆粒(kēlì)的CD45表達(dá)的最小值建立十字門確保所有CD34陽性CD45極弱表達(dá)的細(xì)胞全部在CD45設(shè)定界線的左側(cè)然后根據(jù)此進(jìn)的CD45界線位置確定R1門的最小值第七十二頁，共98頁。第七步絕對計(jì)數(shù)(jìshù)：對于普通流式細(xì)胞儀在樣本中加入標(biāo)準(zhǔn)微球，校準(zhǔn)流式細(xì)胞的計(jì)數(shù)(jìshù)，從而得出干細(xì)胞的濃度Partec流式細(xì)胞儀所有檢測指標(biāo)均為絕對計(jì)數(shù)(jìshù)，無需校準(zhǔn)微球，計(jì)數(shù)(jìshù)過程由硬件完成。第七十三頁，共98頁。陰性(yīnxìng)對照對于陽性細(xì)胞數(shù)很少的樣本，如何建立有效的陰性對照是值得考慮(kǎolǜ)的問題第七十四頁，共98頁。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)(shùjù)保存及分析所有商業(yè)流式細(xì)胞儀樣本分析結(jié)果數(shù)據(jù)包均以FCSII格式保存無論操作(cāozuò)平臺是DOS、Windows、MAC，流式數(shù)據(jù)文件均可被自由拷貝流式數(shù)據(jù)包含有各項(xiàng)參數(shù)信息及分析顆粒信號信息第七十五頁，共98頁。功能強(qiáng)大的免費(fèi)分析(fēnxī)軟件：PC版WinMDI提供流式軟件分析所需的所有功能(gōngnéng)，運(yùn)行在Windows平臺可在任何PC機(jī)上分析流式數(shù)據(jù)并輸出報(bào)告下載：第七十六頁，共98頁。臨床流式細(xì)胞儀應(yīng)用(yìngyòng)簡介以下(yǐxià)將簡單地、舉例性地介紹流式細(xì)胞可開展的部分項(xiàng)目。只須掌握了流式細(xì)胞儀的原理及操作軟件，您可開展任何基于熒光技術(shù)的檢測項(xiàng)目流式細(xì)胞儀是一種任您自由展開想像力的、非凡的檢測工具第七十七頁，共98頁。DNA倍體分析：DNA分析是流式細(xì)胞儀最初且是現(xiàn)在應(yīng)用最廣檢測項(xiàng)目。由于惡性細(xì)胞DNA含量通常與正常細(xì)胞不同，存在異倍體細(xì)胞，所以現(xiàn)有很研究評價(jià)異倍體細(xì)胞與腫瘤惡性度及其預(yù)后的關(guān)系。DNA含量檢測還可提供細(xì)胞周期方面的信息，這在細(xì)胞生物學(xué)中運(yùn)用很廣泛。特別地，它可表示出細(xì)胞毒性藥物對細(xì)胞作用過程。這些DNA檢測還可與細(xì)胞表面標(biāo)志物標(biāo)記同時(shí)進(jìn)行，這樣在細(xì)胞混合培養(yǎng)中，可通常追蹤表達(dá)(biǎodá)特異標(biāo)志物的細(xì)胞顯示其生長周期情況。所有方法都是基于染料能與核酸起特異的化學(xué)反應(yīng)并發(fā)射出熒光，常用的染料為PI，DAPI。流式細(xì)胞儀要求：488nm光源，575nm濾光片。第七十八頁，共98頁。乳腺癌DNA異倍體患者(huànzhě)生存率DNA倍體分析中，S期的含量也是評估疾病預(yù)后的重要(zhòngyào)指標(biāo)第七十九頁，共98頁。DNA倍體的診斷(zhěnduàn)標(biāo)準(zhǔn)1.發(fā)現(xiàn)DNA非整倍體細(xì)胞峰診為癌2.如無明顯(míngxiǎn)的非整倍體細(xì)胞峰便有一個(gè)突出的四倍體細(xì)胞峰和大于15%的超二倍體細(xì)胞S期細(xì)胞并伴G0/1峰的CV值大于9%診為癌3.無明顯(míngxiǎn)的非整倍體細(xì)胞峰但G0/1峰CV值增大并伴有大于10-15%超二倍體細(xì)胞和一個(gè)突出的四倍體峰位診為可疑癌檢測(jiǎncè)是結(jié)合腫瘤標(biāo)記物，特異性地分析腫瘤細(xì)胞的DNA含量有助于提高診斷的準(zhǔn)確率。第八十頁，共98頁。細(xì)胞生存能力實(shí)驗(yàn)，使用Heochest33342染料與DNA特異性結(jié)合，后因細(xì)胞活力不同染料的結(jié)合程度也各異，故可評估細(xì)胞的活性度。流式細(xì)胞儀要求：360nm光源，455nm濾光片計(jì)數(shù)外周血中檢測網(wǎng)織紅細(xì)胞：使用TO染料能夠特異性地與RNA結(jié)合，結(jié)合系數(shù)(xìshù)高達(dá)3000，故具有很好的信噪比。流式細(xì)胞儀要求：488nm光源，525nm濾光片，液量絕對計(jì)數(shù)系統(tǒng)第八十一頁，共98頁。網(wǎng)織紅細(xì)檢測(jiǎncè)網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量(shùliàng)可作為貧血及治療效果的監(jiān)測。RBCsReticulocytesPlateletsNucleatedCellsIRF第八十二頁，共98頁。PlateletAssociatedIg

PAIg血小板自身抗體(kàngtǐ)檢測血小板自身抗體檢測：血小板自身抗體識別人血小板抗原，會引起(yǐnqǐ)各種臨床相關(guān)癥狀，如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫癜、難治性血小板減少。流式細(xì)胞可快速準(zhǔn)確地檢測血小板自身抗體。FITC標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體、PE標(biāo)記識別血小板抗體。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片與網(wǎng)織血小板同時(shí)檢測可時(shí)，兩者均為陽性(yángxìng)時(shí)提示為自身免疫性貧血第八十三頁，共98頁。移植交叉配型：原細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，主要用于避免移植物超急性排拆反應(yīng)。流式細(xì)胞儀用于監(jiān)測(jiāncè)T或B細(xì)胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊，作為HLA配型前的預(yù)實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀因其高精確性已成為該領(lǐng)域內(nèi)的金標(biāo)準(zhǔn)。FITC標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體、PE標(biāo)記識別T細(xì)胞CD3或B細(xì)胞CD29抗體。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片第八十四頁，共98頁。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)(shíyàn)第八十五頁，共98頁。檢測細(xì)胞經(jīng)抗原或細(xì)胞有絲分裂刺激后活化效應(yīng)(xiàoyìng)：淋巴細(xì)胞早期活化指標(biāo)CD69可用來檢測免疫治療效果。流式細(xì)胞使用三色分析可監(jiān)測淋巴細(xì)胞各亞群活化情況：FITC標(biāo)記的CD3抗體、PE標(biāo)記的CD8抗體、PE-CY5標(biāo)記的CD69抗體。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm濾光片細(xì)胞增殖狀態(tài)檢測：核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量細(xì)胞增殖分裂狀況，在評估腫瘤預(yù)后有重要意義。為些標(biāo)志物的檢測一般同細(xì)胞表面標(biāo)志物同時(shí)檢測。FITC標(biāo)記PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5標(biāo)記細(xì)胞表面標(biāo)志物。儀器要求：488nm或633nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片第八十六頁，共98頁。檢測細(xì)胞內(nèi)因子（TH1/TH2細(xì)胞檢測）：未活化的淋巴細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子極少用流式細(xì)胞儀很難檢測出來因此在檢測前需刺激活化活化所用的刺激素為PMA佛波酯+Ionomycin淋巴細(xì)胞在刺激素的作用下活化分泌細(xì)胞因子到細(xì)胞外因流式細(xì)胞儀只能對細(xì)胞表面或內(nèi)部的抗原進(jìn)行檢測如細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外則檢測不到因此必須阻止細(xì)胞因子的分泌抑制細(xì)胞因子分泌的試劑為BrefedlinA或Monensin。Th1/Th2細(xì)胞首先是CD4+T細(xì)胞因此存在著用CD4來設(shè)定細(xì)胞群的問題我們知道CD4不但(bùdàn)在T細(xì)胞上表達(dá)還在所有的單核細(xì)胞上表達(dá)因此單獨(dú)用CD4設(shè)門無法將CD4+T細(xì)胞區(qū)分開來那么我們用CD3和CD4雙參數(shù)設(shè)門是否可以呢回答是否定的因?yàn)樵诜鸩サ拇碳ぷ饔孟翪D4抗原的表達(dá)會迅速下調(diào)甚至完全喪失所以不適合于設(shè)門用CD3和CD8設(shè)門因CD8不受佛波脂的影響且絕大多數(shù)D3+CD8-的細(xì)胞都是CD3+CD4+細(xì)胞因此可用CD3+CD8-細(xì)胞群來確定CD4+T細(xì)胞群。FITC標(biāo)記CD8，PE標(biāo)記IL-4和，PE-CY5標(biāo)記IFN-r，APC或PE-CY7標(biāo)記CD3。

儀器要求：488nm或633nm（僅限APC染料）光源，525nm、575nm、675nm，767nm濾光片第八十七頁，共98頁。染色體分析：流式細(xì)胞儀染色分析運(yùn)用兩種特異性染料：Hoechest33258與核苷酸AT結(jié)合；ChromomycinA3與GC相結(jié)合。從而在雙參數(shù)坐標(biāo)上根據(jù)染色體ATCG含量的不同識別各種染色體。平時(shí)進(jìn)行的染色體分析耗時(shí)且需要操作者極具經(jīng)驗(yàn)，而用流式細(xì)胞儀時(shí)可快速地識別出異常染色體，如加配分選系統(tǒng)可將這些異常染色體分選出來作進(jìn)一步分析。儀器(yíqì)要求：360nm或488nm光源，450nm、580nm濾光片BrdUrd標(biāo)記追蹤細(xì)胞分化：通過細(xì)胞分化時(shí)涉入溴化尿嘧啶，再使用抗BrdUrd抗體及PI核酸染料可精確識別它們。在流式細(xì)胞儀上可清楚地識別出處于G1、S、G2、M期的細(xì)胞，在腫瘤研究中有著重要作用。儀器(yíqì)要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片第八十八頁，共98頁。淋巴細(xì)胞亞群分析：外周血CD3、CD4、CD8、CD19、NK等各類淋巴細(xì)胞亞群定量分析。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片，液量絕對計(jì)數(shù)(jìshù)系統(tǒng)

白血病免疫分型：CD45設(shè)門三色白血病免疫分型。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片。最少三色熒光，參數(shù)越多檢測越為靈敏。

血小板分析：血小板活化實(shí)驗(yàn)、血小板功能分析。血小板識別抗體及相應(yīng)活化指標(biāo)。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片，液量絕對計(jì)數(shù)(jìshù)系統(tǒng)第八十九頁，共98頁。血小板分析：血小板活化實(shí)驗(yàn)、血小板功能分析。血小板識別抗體及相應(yīng)活化指標(biāo)。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片，液量絕對計(jì)數(shù)系統(tǒng)白血病、淋巴瘤微小殘留病灶檢測：根據(jù)初診免疫分型結(jié)果，多參數(shù)聯(lián)合設(shè)門檢測是否有殘留白血病細(xì)胞(xìbāo)，監(jiān)測白血病的復(fù)發(fā)。T系白血病微小殘留病灶檢測儀器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片，液量絕對計(jì)數(shù)系統(tǒng)B系白血病微小殘留病灶檢測，液量絕對計(jì)數(shù)系統(tǒng)儀器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片。最少三色熒光，參數(shù)越多檢測越為靈敏。髓系白血病微小殘留病灶檢測，液量絕對計(jì)數(shù)系統(tǒng)儀器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片。最少三色熒光，參數(shù)越多檢測越為靈敏。第九十頁，共98頁。血小板活化(huóhuà)實(shí)驗(yàn)要求減少血小板聚集聚集血小板在流式細(xì)胞儀可被檢測出來但是如果血小板發(fā)生了聚集流式細(xì)胞儀便不能檢測聚集血小板中每個(gè)血小板所表達(dá)的抗原數(shù)量了這是因?yàn)榱魇街粰z測每個(gè)顆粒的表達(dá)熒光而無法區(qū)分這個(gè)顆粒單個(gè)血小板還是由一定數(shù)量血小板聚積而成在準(zhǔn)備全血標(biāo)本時(shí)可依據(jù)以下標(biāo)本處理方法使血小板聚集現(xiàn)象減到最低對于每個(gè)樣本(yàngběn)都要監(jiān)測血小板的聚集情況聚集血小板往往會出現(xiàn)在FS和SS坐標(biāo)中右上象限內(nèi)減少全血標(biāo)本中血小板聚集的標(biāo)本處理方法?在抽血前準(zhǔn)備好所有在標(biāo)本處理過程中所需試劑以避免延誤時(shí)間?抽血時(shí)針管不要細(xì)于21號?平穩(wěn)放松地抽取血液?棄用前2ml血液?使用聚乙稀試管或針筒?立即與抗凝劑混勻?不要進(jìn)行洗滌離心過濾晃動等巨烈的處理步驟?加入緩沖液稀釋血小板濃度?如果要使用凝血酶作為激活劑則在其中要加入肽GPRP第九十一頁，共98頁。固定檢測血小板活化都需要限制血小板自身的或被激活的體外活化通過抗激活藥物肌苷潘生丁或固定方法通常(tōngcháng)使用多聚甲醛都可限制血小板自發(fā)或被動活化固定或許會破化某抗原與單抗結(jié)合的位點(diǎn)如用福爾馬林固定標(biāo)體還會引起血小板的自發(fā)熒光所以在檢測中選用恰當(dāng)?shù)年幮詫φ沾送夤潭ǖ臉?biāo)本中不應(yīng)存在未結(jié)合的抗體這會引起非特異性結(jié)合建議先將標(biāo)本與抗體孵育洗去未結(jié)合抗體后固定然而這會在處理過程引起額外的血小板活化并且這很難控制對血小板進(jìn)行固定對于臨床不能立即上流檢測的標(biāo)本來說是極為有利的方法固定可以減少血小板在體外的人為活化對于絕大多數(shù)抗體來說使用染色后再固定的方法進(jìn)行處理的標(biāo)本立即上機(jī)檢測與在24小時(shí)內(nèi)分析在熒光強(qiáng)度上沒有明顯差異并且固定前染色方法并立即上機(jī)檢測與固定后24小時(shí)內(nèi)染色分析在熒光強(qiáng)度上也沒有明顯差異然而要注意因固定方法而對標(biāo)本引起的變化特別是使用固定前染色的單抗時(shí)因?yàn)閷τ跈z測血小板活化依賴性單抗與固定后的血小板結(jié)合率會有下降此外有些單抗與固定后的血小板結(jié)合率會表現(xiàn)出時(shí)間相關(guān)性減少所以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室在使用種新抗體時(shí)必須選擇最恰當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ǖ诰攀摚?8頁。細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)分析：DNA凋亡(diāowánɡ)峰檢測、ANNEXIN-V/PI雙染法凋亡(diāowánɡ)檢測。儀器要求：48