第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法(6學(xué)時(shí))匯總

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察形成可驗(yàn)證的假說(shuō)設(shè)計(jì)試驗(yàn)收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識(shí)生物學(xué)研究模式生物是基于不同物種享有共同分子機(jī)制雖然鯨魚(yú)與人類(lèi)的體型大小差別很大，但是基因卻差別不大，有很多同源基因。CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

1光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

2

電子顯微鏡技術(shù)

(Electromicroscopy)3掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)

普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LaserScanningConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

分辨率是指區(qū)分開(kāi)兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離各種顯微鏡的分辨率梯度普通光學(xué)顯微鏡樣品一般經(jīng)固定、染色后觀察較厚樣品切片后觀察。普通光學(xué)顯微鏡制片技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）FluorescentMicroscopeObjectiveArcLamp(弧光燈)

EmissionFilterExcitationDiaphragm(光圈)Ocular(目鏡)Excitation

Filter熒光顯微鏡光路圖熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）應(yīng)用

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

間接熒光標(biāo)記技術(shù)(免疫熒光標(biāo)記技術(shù))

FluorescenceMicroscopeimageofHoechststainedcells(plusDIC)Imagecollectedwitha470TOptronicscooledcamera直接熒光標(biāo)記技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）應(yīng)用

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

間接熒光標(biāo)記技術(shù)(免疫熒光標(biāo)記技術(shù))

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

應(yīng)用：綠色熒光蛋白激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理：FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterObjectiveLaserEmissionPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterConfocalMicroscope普通熒光顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡激光共焦掃描顯微系統(tǒng)(Confocal

System)激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理：應(yīng)用： 排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng) 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，通過(guò)“光切片”觀察樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。PineTreepollen-collectedonaBio-RadMRC1024atPurdueUniversityCytometryLaboratories

利用光切片技術(shù)顯示的花粉內(nèi)部結(jié)構(gòu)1為轉(zhuǎn)GFP基因的煙草單細(xì)胞；2為轉(zhuǎn)SCaM1-GFP融合基因的煙草單細(xì)胞；3為轉(zhuǎn)SCaM4-GFP融合基因的煙草單細(xì)胞。

質(zhì)壁分離后轉(zhuǎn)基因煙草單細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞壁細(xì)胞膜細(xì)胞核細(xì)胞壁細(xì)胞壁細(xì)胞膜細(xì)胞核細(xì)胞膜細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞膜細(xì)胞壁細(xì)胞核細(xì)胞膜熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）活體檢測(cè)生物大分子的相互作用

蛋白質(zhì)間的相互作用（10nm）受體-供體（CFP-YFP）激發(fā)光，發(fā)射光錢(qián)永健2008年NobelFRET就是采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近（1-10nm）時(shí)，將光子能從一個(gè)受激發(fā)的熒光團(tuán)（供體）轉(zhuǎn)移到另一個(gè)熒光團(tuán)（受體）CFP受光激發(fā)后便發(fā)射光CFP受光激發(fā)后但沒(méi)有發(fā)射小光。CFP離YFP的距離大于10nmCFP與YFP非常接近（1-10nm）YFP沒(méi)有受到激發(fā)，因此也不發(fā)射光CFP沒(méi)有受光激發(fā)，但發(fā)射光2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

RogerTsien對(duì)GFP的機(jī)理作出了貢獻(xiàn)。制造了很多GFP突變體。相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于觀察活細(xì)胞

微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）

偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成 明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）

計(jì)算機(jī)輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活 細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)相差顯微技術(shù)相差顯微鏡與微分干涉顯微鏡的光路比較以及圖片示例錄像增差顯微鏡技術(shù)圖片示例二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識(shí)電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造

電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMEM200nm100nm0.1nm可見(jiàn)光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子束照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識(shí)電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)

負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)超薄切片技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)固定

包埋切片染色超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù)圖片示例主要電鏡制樣技術(shù)

負(fù)染色技術(shù)（Negativestaining）

用重金屬鹽對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色。襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)，如病毒核糖體等結(jié)構(gòu)。

冷凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）

冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來(lái)觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。

冷凍蝕刻主要電鏡制樣技術(shù)

電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。

三維重構(gòu)技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識(shí)電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)超薄切片技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

掃描電鏡原理與應(yīng)用：

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成象。

CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問(wèn)題掃描電鏡原理與圖片示例三、掃描遂道顯微鏡ScanningTunnelingMicroscope,STM80年代發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器。(Nobel獎(jiǎng))反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。特點(diǎn)：分辨率高：

側(cè)分辨率：分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達(dá)0.001nm不受介質(zhì)限制非破壞性

用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)，觀察生物大分子、膜、病毒等的結(jié)構(gòu)。紅細(xì)胞用掃描隧道顯微鏡在高定向裂解石墨表面上刻寫(xiě)的漢字“中國(guó)”，其中筆畫(huà)的線條寬度為10nm。用掃描隧道顯微鏡畫(huà)出來(lái)的中國(guó)地圖其比例尺為l∶1013。這是目前世界上最小的中國(guó)地圖。如果用這樣大小的漢字來(lái)書(shū)寫(xiě)《紅樓夢(mèng)》一書(shū)，只需大頭針針頭那樣小的面積，就可寫(xiě)進(jìn)全書(shū)的內(nèi)容。

3.特異蛋白抗原的定位與定性

2.細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類(lèi)的顯示方法

4.細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

5.放射自顯影技術(shù)

6.定量化學(xué)分析技術(shù)

1.離心分離技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、離心分離技術(shù)

用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物

差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分

密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離差速離心密度梯度離心;連續(xù)密度梯度（等密度沉降）不連續(xù)密度梯度（速度沉降）常用的介質(zhì)：蔗糖、氯化銫、甘油等。

原理：利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過(guò)顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來(lái)判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。

FeulgenStaining：DNA

蘇丹染色:脂肪和膽固醇

Millon染色：蛋白質(zhì)

PAS反應(yīng)：多糖二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)酶、糖與脂類(lèi)的顯示方法三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)

快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限

免疫熒光技術(shù)圖片示例三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)

快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限免疫電鏡技術(shù)免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)應(yīng)用：能對(duì)蛋白進(jìn)行精細(xì)定位。如通過(guò)對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。

免疫膠體金技術(shù)原理與圖片示例三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)

快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限免疫電鏡技術(shù)免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)應(yīng)用：能對(duì)蛋白進(jìn)行精細(xì)定位。如通過(guò)對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。蛋白電泳(SDS)與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

五、放射自顯影技術(shù)原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究。步驟：放射性前體分子摻入細(xì)胞內(nèi)同位素位置的顯示

六．定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)特異光譜的吸收，測(cè)定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。 包括：紫外光顯微分光光度測(cè)定法可見(jiàn)光顯微分光光度測(cè)定法

流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）主要應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；分離DNA含量不同的中期染色體。流式細(xì)胞儀原理第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程

1細(xì)胞的培養(yǎng)2細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞的培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 類(lèi)型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturecell） 傳代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culturecell） 有限細(xì)胞系（cellline）40-50代，染色體正常，接觸抑制永生細(xì)胞系：染色體改變，接觸抑制喪失，無(wú)限傳代細(xì)胞株：從細(xì)胞中分離單個(gè)細(xì)胞，具有特殊遺傳標(biāo)記或性質(zhì)植物細(xì)胞培養(yǎng)非細(xì)胞體系（cell-freesystem）

Hela細(xì)胞（左）、CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng)一、細(xì)胞的培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)

類(lèi)型：

單倍體細(xì)胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）原生質(zhì)體培養(yǎng)（體細(xì)胞培養(yǎng)）

一、細(xì)胞的培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)

非細(xì)胞體系（cell-fr