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文檔簡(jiǎn)介

液相色譜的基礎(chǔ)知識(shí)及應(yīng)用第一頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日Contents液相色譜法發(fā)展史與分類(lèi)1色譜方法基本原理2345樣品分析方法的建立液相色譜的維護(hù)及注意事項(xiàng)軟件的簡(jiǎn)單介紹及示范第二頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日1液相色譜發(fā)展歷史與分類(lèi)1.1色譜的起源(1903)Chromatography色譜M.S.Tswett第三頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日IUPACdefinitionofchromatography(1993): Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichthecomponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases,oneofwhichisstationarywhiletheothermovesinadefinitedirection.固定相(stationaryphase):在色譜分離中固定不動(dòng)、對(duì)樣品產(chǎn)生保留的一相。流動(dòng)相(mobilephase):帶動(dòng)樣品向前移動(dòng)的另一相。色譜法:是一種物理化學(xué)分離方法,它利用不同組分與兩相(固定相和流動(dòng)相)之間的作用力(分配、吸附、離子交換等)的差別,樣品在兩相中做相對(duì)移動(dòng)時(shí),各組分在兩相間進(jìn)行多次平衡,使不同物質(zhì)達(dá)到相互分離。1.2色譜的定義第四頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日1.3色譜的發(fā)展歷程第五頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日第六頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日1.4色譜中的分離過(guò)程定性定量串聯(lián)應(yīng)用樣品純化成分分析分離第七頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日色譜中的分離過(guò)程咖啡流動(dòng)相固定相利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解、分配、吸附等化學(xué)作用性能的差異,當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離第八頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日1.5色譜的分類(lèi)按流動(dòng)相的物態(tài)分:–氣相色譜(GasChromatography,GC):用氣體作為流動(dòng)相(又叫載氣)–液相色譜(LiquidChromatography,LC):用液體作為流動(dòng)相(又叫洗脫劑)按固定相的形態(tài)分:–平面色譜紙色譜薄層色譜

–柱色譜按流動(dòng)相和固定相的相對(duì)極性–正相色譜(NormalPhaseChromatography)

固定相的極性大于流動(dòng)相–反相色譜(ReversedPhaseChromatography)

固定相的極性小于流動(dòng)相第九頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日HPLC與

GC的應(yīng)用差異第十頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日HPLC與

GC的應(yīng)用差異揮發(fā)非揮發(fā)疏水性親水性糖環(huán)氧化合物多氯聯(lián)苯脂肪酸甲酯芳香酯C2/C5碳?xì)浠衔餆o(wú)機(jī)離子氨基酸糖類(lèi)衍生物香精油聚合物單體甘油三酸酯磷脂亞硝胺有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑酒精多環(huán)芳烴芳族胺脂溶性維生素抗體天然食用色素類(lèi)黃酮抗生素腈類(lèi)抗氧化劑乙二醇脂肪酸磺胺類(lèi)揮發(fā)性羧酸醛酮類(lèi)甘草膦合成食用色素苯酚黃曲霉毒素酶糖醇第十一頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日2.色譜方法基本原理色譜的主要理論熱力學(xué)理論以相的平衡觀點(diǎn)研究色譜過(guò)程

塔板理論為代表

(Martin&Synge)動(dòng)力學(xué)理論以動(dòng)力學(xué)觀點(diǎn)研究各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)色譜峰的影響

VanDeemter方程為代表MartinSynge第十二頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日

分離的原理樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間的分配

流動(dòng)相帶動(dòng)樣品經(jīng)過(guò)色譜柱

不同組分與固定相之間相互作用的強(qiáng)度不同

不同組分在固定相上移動(dòng)速度不同,

形成分離分配系數(shù)

KDXmXsKD1=[Xs]/[Xm]YmYsKD2=[Ys]/[Ym]

流動(dòng)相固定相第十三頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日

樣品組分的分離進(jìn)樣、分配、移動(dòng)、流出、分離KD2<KD1,所以Y先流出來(lái)第十四頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日分配系數(shù)K分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān),也與溫度、壓力有關(guān)。在條件(流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等)一定,樣品濃度很低時(shí)(Cs、Cm很?。r(shí),K只取決于組分的性質(zhì),而與濃度無(wú)關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件,在這種條件下,得到的色譜峰為正常峰;在許多情況下,隨著濃度的增大,K減小,這時(shí)色譜峰為拖尾峰;而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大,K也增大,這時(shí)色譜峰為前延峰。因此,只有盡可能減少進(jìn)樣量,使組分在柱內(nèi)濃度降低,K恒定時(shí),才能獲得正常峰。在同一色譜條件下,樣品中K值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長(zhǎng),后流出色譜柱;K值小的組分則滯留時(shí)間短,先流出色譜柱?;旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大,越容易分離,因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。在HPLC中,固定相確定后,K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值,以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間,達(dá)到分離的目的。第十五頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日樣品組分分離情況A.樣品與色譜柱固定相無(wú)任何作用

三種樣品在

t0時(shí)間流出,

無(wú)保留無(wú)保留時(shí)間B.樣品組分保留時(shí)間一致與色譜柱作用力相同

C.樣品組分保留時(shí)間不一致

樣品各組分與色譜柱作用力不同

D.實(shí)際分離狀況高斯分布曲線(xiàn)第十六頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日

色譜出峰形狀實(shí)際出峰形狀為高斯分布曲線(xiàn)(Gaussiancurve)樣品的擴(kuò)散效應(yīng)無(wú)擴(kuò)散樣品擴(kuò)散第十七頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日

分離度

分離度(Resolution)兩個(gè)相鄰峰的分離程度。以?xún)蓚€(gè)組份保留值之差與其平均半峰寬值的比來(lái)表示:R=?時(shí)兩峰認(rèn)為已分開(kāi)?第十八頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日

不同分離度

R相鄰兩吸收峰分離度R=1.0,98%,

基線(xiàn)分離R=1.5,99.7%R>=1.5時(shí),完全分離(中國(guó)藥典規(guī)定)兩色譜峰被視為分開(kāi)第十九頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日

分離度R的數(shù)學(xué)表達(dá)分離度R的基本公式k’:容量因子(capacityfactor)反映吸收峰的保留特性:選擇因子(selectivityfactor)反映相鄰兩色譜峰的分離程度

——色譜過(guò)程熱力學(xué)因素N:理論塔板數(shù),反映色譜柱的分離效率

(columnefficiency)——色譜過(guò)程動(dòng)力學(xué)因素有關(guān)R=1/4Nxxk'1+k'-1柱效選擇因子容量因子第二十頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日

容量因子k’測(cè)量溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中分布的摩爾數(shù)(量)之比

與溫度有關(guān)(GC)與流動(dòng)相溶劑種類(lèi)及組成有關(guān)(LC)Injectiont0t’RtR第二十一頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日k’決定樣品能進(jìn)入色譜柱固定相的量k’太小,在固定相上保留太短,很快流出,難以確定保留時(shí)間

k’太大,在固定相上保留太強(qiáng),洗脫時(shí)間太長(zhǎng),

理想的k’為1~5

第二十二頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日

分離效果與

k’值的最優(yōu)化

k’值的優(yōu)化改變?nèi)軇┏煞?、梯度條件

(洗脫強(qiáng)度)第二十三頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日

選擇因子

色譜柱分開(kāi)兩組份的能力

>1時(shí)兩組分分離表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異,即分子間相互作用力的差異。t0t’R1t’R2Injection第二十四頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日選擇因子

的影響因素影響

的因素

改變流動(dòng)相成分,包括改變

pH

值改變柱溫

(在LC不明顯)改變固定相成分使用特殊化學(xué)效應(yīng)第二十五頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日理論板數(shù)

N塔板理論熱力學(xué)平衡理論色譜柱效的量化從分餾法技術(shù)衍生而來(lái)分離法依組分揮發(fā)性不同而分餾色譜法依組分分配系數(shù)不同而分離分配系數(shù)

K=Cs/Cm理論板數(shù)

N、塔板高度

H柱效隨

N增大和

H減小而增加分配色譜流程模型N=L/H第二十六頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日理論塔板數(shù)N

與半峰寬W1/2和保留時(shí)間的關(guān)系如下在相同保留時(shí)間色譜峰越尖銳,則色譜柱效越高

第二十七頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日

分離效能的最優(yōu)化增加容量增加選擇因子增加柱效增加k’值可增加分離度但會(huì)增加分析時(shí)間改變流動(dòng)相、固定相成分

增加值可增加分離度但不能因此影響

k’值第二十八頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日液相色譜儀設(shè)備概述第二十九頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日液相色譜儀器組成溶劑傳輸系統(tǒng)(泵系統(tǒng))進(jìn)樣系統(tǒng)檢測(cè)器工作站組分收集(選項(xiàng))第三十頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日液相色譜儀器結(jié)構(gòu)組成示意圖流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶單元或多元泵梯度混合器預(yù)柱手動(dòng)-進(jìn)樣器自動(dòng)-進(jìn)樣器保護(hù)柱色譜柱柱后反應(yīng)器柱溫箱檢測(cè)器餾分收集器積分儀工作站計(jì)算機(jī)接口溫度控制單元樣品制備單元第三十一頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日3.樣品分析方法開(kāi)發(fā)

第三十二頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日第三十三頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日樣品預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的是為了純化樣品。完成純化的方法有:稀釋-

用一種互溶的且比流動(dòng)相弱的溶劑或流動(dòng)相本身稀釋樣品過(guò)濾-

有不同孔徑的過(guò)濾材料.

提示:有的化合物可能吸附在過(guò)濾器上,從而影響定量.離心-

可除去樣品中的顆粒物質(zhì).萃取-液液萃取,固相萃取揮發(fā)-采用惰性氣體通過(guò)樣品鼓泡或抽真空除去溶劑樣品準(zhǔn)備第三十四頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日優(yōu)化概覽優(yōu)化應(yīng)當(dāng)是系統(tǒng)進(jìn)行的,也就是說(shuō)每個(gè)參數(shù)應(yīng)當(dāng)逐步變化.

!!每次運(yùn)行只改變一個(gè)參數(shù)!!目標(biāo)是在最短的分析時(shí)間內(nèi)獲得最好的分離結(jié)果.

優(yōu)化溶劑強(qiáng)度

流速

溫度

柱長(zhǎng)

固定相*優(yōu)化第三十五頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相的選擇原則是:①樣品易溶,且溶解度盡可能大。②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,不損壞柱子。③不妨礙檢測(cè)器檢測(cè),紫外波長(zhǎng)處無(wú)吸收。④粘度低,流動(dòng)性好。⑤易于從其中回收樣品。⑥無(wú)毒或低毒,易于操作。⑦易于制成高純度,即色譜純。⑧廢液易處理,不污染環(huán)境。反相色譜最常用的流動(dòng)相及其沖洗強(qiáng)度如下:

H2O<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<異丙醇<四氫呋喃正相色譜常用的流動(dòng)相及其沖洗強(qiáng)度的順序是:正己烷<乙醚<乙酸乙酯<異丙醇第三十六頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日系統(tǒng)方法開(kāi)發(fā))選擇初始色譜柱(直徑,長(zhǎng)度,填料粒度)-4.6x250mm,5m使用適當(dāng)?shù)目讖匠跏歼\(yùn)行采用與流動(dòng)相組成條件一致的pH)優(yōu)化k*(保留)梯度范圍,時(shí)間,斜率流動(dòng)相-很小變化)優(yōu)化回收率樣品的溶解性溫度的作用鍵合相的作用有機(jī)改性劑)優(yōu)化

*

(選擇性)溫度鍵合相pH(最后的手段))優(yōu)化

N(色譜柱條件)流速長(zhǎng)度填料粒度第三十七頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日分離度與k’,N,和的關(guān)系初始改變k'提高N提高a梯度范圍,斜率流速,填料粒度,柱長(zhǎng)溫度、流動(dòng)相、pH優(yōu)化第三十八頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日色譜的定性分析色譜定性分析:

用保留值定性和色譜聯(lián)用技術(shù)(如LC-MS、LC-FTIR)定性利用保留值定性基本依據(jù):兩個(gè)相同的物質(zhì)在相同的色譜條件下應(yīng)該有相同的保留值。但是,相反的結(jié)論卻不成立,即在相同的色譜條件下,具有相同保留值的兩個(gè)物質(zhì)不一定是同一個(gè)物質(zhì)利用已知物直接對(duì)照進(jìn)行定性分析用絕對(duì)保留值定性--一般要求用自動(dòng)進(jìn)樣用相對(duì)保留值定性用已知物增加峰高法定性利用文獻(xiàn)值對(duì)照進(jìn)行定性分析--采用保留指數(shù)(I)第三十九頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日檢測(cè)器信號(hào)響應(yīng)與時(shí)間的關(guān)系測(cè)量每個(gè)峰的保留時(shí)間tR1t0tR2timesignal第四十頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日色譜的定量分析檢測(cè)器信號(hào)響應(yīng)與時(shí)間的關(guān)系測(cè)量每個(gè)峰的峰面積第四十一頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日定量分析的基本公式:

Mi–i組分的量;Ai–i組分的峰面積;fi–i組分的校正因子,與檢測(cè)器的行為和被測(cè)組份的行為有關(guān)。定量分析的依據(jù)是被測(cè)組分的量與響應(yīng)信號(hào)成正比,但相同含量的物質(zhì)由于物理、化學(xué)性質(zhì)的差別,即使在同一檢測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào)也不同,直接用響應(yīng)信號(hào)定量,必然導(dǎo)致較大誤差。故引入校正因子。校正因子是定量計(jì)算公式中的比例常數(shù),其物理意義是單位面積所代表的被測(cè)組分的量。

第四十二頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日1.面積百分法(AreaPercent)2.外標(biāo)法(ExternalStandard)3.內(nèi)標(biāo)法(InternalStandard)4.歸一化法(NormalizedPercent)色譜定量分析方法的種類(lèi)第四十三頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日面積百分法

最簡(jiǎn)單的計(jì)算方法樣品中的所有成分對(duì)檢測(cè)器的響應(yīng)值相同樣品中的所有成分必須完全分離表示樣品中單一組份相對(duì)于其他組份的含量

面積%=(AI/ΣA)*100AI=單一色譜峰的面積

ΣA=全部色譜峰的面積之和不要求進(jìn)樣量準(zhǔn)確不適用于選擇性檢測(cè)器第四十四頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日歸一化法(Normalized%)將樣品中所有組份的含量之和定為100%。計(jì)算其中某一組份百分含量的定量方法:其中:xi-試樣中組份I的百分含量

fi-組份I的校正因子

Ai-組份I的峰面積或峰高第四十五頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日歸一化法示例

化合物 峰面積 校正因子 峰面積×校正因子 百分比含量C8 200 1.2 240 240/1708=14.1%C12 230 1.6 368 368/1708=21.5%C16 200 1.8 360 360/1708=21.1%C18 300 1.8 540 540/1708=31.6%C20 100 2.0 200

200/1708=11.7% 1030 1708 100%優(yōu)點(diǎn):方法簡(jiǎn)便,進(jìn)樣量與載氣流速的影響不大缺點(diǎn):樣品中所有組份必須都能出峰,并且必須知道各自組份的校正因子(校正因子需要由已知的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)求得)。歸一化法主要用于氣相色譜的定量測(cè)定。且一般只適用于通用型檢測(cè)器。第四十六頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日直接峰面積歸一化--無(wú)校正因子法%(NOCalibration)當(dāng)樣品中各組份的校正因子近似相等,如同系物或同分異構(gòu)體,可直接用峰面積歸一化進(jìn)行定量。即簡(jiǎn)化為下式:示例:給出了采用校正因子和不用校正因子進(jìn)行歸一化法的定量結(jié)果組份乙苯對(duì)二甲苯間二甲苯鄰二甲苯峰面積(Ai)校正因子(fi’)f’*Ai1200.97116751.00751400.961341050.98103校正因子歸一化法定量結(jié)果直接峰面積歸一化定量結(jié)果27.027.217.517.131.331.824.123.9第四十七頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日多點(diǎn)校正的定量分析單點(diǎn)校準(zhǔn)峰面積進(jìn)樣量峰面積進(jìn)樣量響應(yīng)值=樣品量unn=峰面積響應(yīng)值峰面積進(jìn)樣量多點(diǎn)校準(zhǔn)第四十八頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日外標(biāo)法(ExternalStandard)-又稱(chēng)校正曲線(xiàn)法在相同分析條件下,比較標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與樣品的色譜峰面積或峰高1.用已知的標(biāo)準(zhǔn)品配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列,在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下,等體積準(zhǔn)確進(jìn)樣,測(cè)量各種濃度的峰高或峰面積,繪制響應(yīng)信號(hào)與百分含量的關(guān)系曲線(xiàn);2.測(cè)量樣品的峰面積或峰高,在校正曲線(xiàn)上查出其對(duì)應(yīng)的百分含量。第四十九頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日外標(biāo)法定量第五十頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日濃度峰面積標(biāo)準(zhǔn)1127187標(biāo)準(zhǔn)24012845標(biāo)準(zhǔn)38021437標(biāo)準(zhǔn)412027557標(biāo)準(zhǔn)514031440樣品結(jié)果直接在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)上讀出,非常簡(jiǎn)單,尤其對(duì)大量樣品分析時(shí)特別適合。要求進(jìn)樣量、色譜分析條件嚴(yán)格不變;容易出現(xiàn)較大誤差。第五十一頁(yè),共五十六頁(yè),2022年,8月28日內(nèi)標(biāo)法(Inter

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