第六胚胎工程演示文稿

第六胚胎工程演示文稿第一頁，共一百零六頁。優(yōu)選第六胚胎工程第二頁，共一百零六頁。一、胚胎發(fā)育的基本過程和機制（一）精卵發(fā)生（二）受精（三）卵裂（四）囊胚的形成（五）原腸胚及胚層的形成和分化（六）動物早期胚胎發(fā)育及其分子機制第三頁，共一百零六頁。（一）精卵的發(fā)生哺乳動物的生殖是一個相當復雜的生命現象，在胚胎早期，生殖細胞首先與體細胞分離，形成的細胞為原生殖細胞(PGCs),其后，經過性別決定和將要進行的性別分化，形成兩種生殖細胞。生殖細胞經過增殖期、生長期和成熟期,最終形成精子和卵子。第四頁，共一百零六頁。1.精子

a.精子的結構頭部：頂體、細胞核尾部：頸、中段、主段和末端。頂體內部含有水解酶，能協助精子穿入卵周圍的卵膜。精子質膜外表面存在有多種凝集素受體。鞭毛為9＋2微管結構第五頁，共一百零六頁。b.精子的發(fā)生第六頁，共一百零六頁。精原細胞有絲分裂初級精母細胞次級精母細胞精子細胞精子MⅠ第一階段第二階段第三階段MⅡ多個精原細胞染色體復制變形精原細胞經過有絲分裂產生多個初級精母細胞。初級精母細胞經減數分裂形成含有單倍染色體的精子細胞。細胞核變?yōu)榫宇^部的主要部分；高爾基體發(fā)育為頭部的頂體；中心體演變?yōu)榫拥奈玻痪€粒體形成線粒體鞘膜；其它物質濃縮成原生質滴（球形）第七頁，共一百零六頁。卵細胞內部物種空間結構排列具有極性，卵內組分沿著卵的主軸分布不均勻，形成動物級和植物級。卵黃積聚在植物級。卵細胞分布在兩個固定的區(qū)域，質膜下細胞質稱為皮層，皮層是高度粘滯、半硬的凝膠狀，內含有皮層顆粒和色素顆粒。大部分卵細胞質——內質是液體狀態(tài)，內含線粒體和生殖質。卵細胞排出卵巢后，有卵膜包被2.卵子

a.卵子的結構第八頁，共一百零六頁。b.卵子的發(fā)生一個卵巢包含三個世代的卵母細胞，每當一個世代的卵母細胞成熟后，就被新的世代所取代。在哺乳類，所有卵原細胞成熟后和卵原細胞轉變?yōu)槁涯讣毎窃谔悍置淝巴瓿?。卵母細胞形成階段是從胎兒誕生開始一到性成熟排卵為止。直到青春期卵母細胞才進行生長，以后每個性周期后有一批新的卵母細胞繼續(xù)發(fā)育，而多數卵母細胞在每個周期發(fā)育中未成熟就退化。卵母細胞的成熟過程受MPF(成熟促進因子）和CSF（細胞生長抑制因子）的相互調節(jié)。第九頁，共一百零六頁。卵巢激素控制示意圖第十頁，共一百零六頁。b.卵子的發(fā)生1）、場所：卵子的發(fā)生是在卵巢內完成的。2）、時期：性別分化以后（放射冠）第十一頁，共一百零六頁。c、過程：雌性胎兒卵巢內的卵原細胞，通過有絲分裂增加其數量，演變?yōu)槌跫壜涯讣毎?，被卵泡細胞包圍形成卵泡。初級卵母細胞經過減數分裂變?yōu)槌墒斓穆炎?。減數第一次分裂時間是在雌性動物排卵前后完成的，結果是產生1個次級卵母細胞和第一極體。減數第二次分裂時間是在精子和卵子結合的過程中，結果是產生1個成熟卵子和第二極體。第十二頁，共一百零六頁。卵原細胞有絲分裂多個卵原細胞染色體復制初級卵母細胞MⅠ第一極體次級卵母細胞兩個第二極體第二極體卵子退化消失MⅡ排卵前后完成在受精過程完成被卵泡細胞包圍,形成卵泡胎兒時期完成第十三頁，共一百零六頁。3、精子與卵子的發(fā)生比較場所開始時間細胞增殖方式子細胞數目是否變形重要區(qū)別精子睪丸初情期以后先有絲分裂后減數分裂

4個精子細胞變形哺乳動物卵泡的形成和在卵巢內的儲備是在出生前完成的；而精子是從初情期開始的卵子卵巢輸卵管性別分化以后先有絲分裂后減數分裂

1個卵細胞,3個極體不變形相似點：最初階段均進行有絲分裂，不斷增加生殖原細胞的數量；經過兩次減數分裂（MⅠ和MⅡ）才能形成精子和卵子。不同點：一個精原細胞——多個精子；一個卵原細胞——一個卵子；精子形狀為蝌蚪狀；卵子為球形。多數哺乳動物卵子的形成和在卵巢內的貯備是胎兒出生前完成的。第十四頁，共一百零六頁。（二）受精作用概念:指精子和卵子結合形成合子(即受精卵)的過程。標志:在卵黃膜和透明帶的間隙可以觀察到兩個極體時。場所:受精是在輸卵管內完成的。第十五頁，共一百零六頁。1.精子的成熟和獲能精子離開精巢后，無使卵受精的能力，它必須經過在附睪中成熟及在雌性生殖道內獲能，才具有使卵受精的能力。在附睪液和精液中存在著附睪蛋白和精清蛋白，稱為去獲能因子，精液中的精子表面被覆了這種因子。在雌性生殖道中的分泌物可以去掉這些覆蓋物而使精子質膜、頂體發(fā)生一系列變化第十六頁，共一百零六頁。b.受精前的準備階段準備階段1：精子獲能準備階段2：卵子的準備即精子必須在雌性動物生殖道內發(fā)生相應生理變化后，才能獲得受精能力的現象。即卵子在輸卵管內達到減數第二分裂中期（MⅡ）時，才具備受精能力。a.精子的行進：精子在陰道和子宮內的運動速度很快，十幾分鐘即達到輸卵管，積聚在輸卵管峽部下2－3cm處，在此停留十幾到幾十個小時，然后繼續(xù)上行；只有少數精子可以達到卵管壺峽連接部，在此與剛排出的卵相遇，完成受精過程。第十七頁，共一百零六頁。2.頂體反應

定義：精子在同卵子表面接觸或與卵膜分泌的物質相遇后，精子的頂體就會發(fā)生一系列的變化。精子頂體帽部分的質膜和頂體外膜在卵的透明帶卵丘及輸卵管分泌物的作用下，在多處發(fā)生融合，因此在該部出現很多裂口，使得頂體內部的物質釋放出來，包括各種水解酶，從而使它們在受精中起作用第十八頁，共一百零六頁。3.穿過放射冠：在卵子外圍集聚有幾十個精子，它們首先穿放射冠。第十九頁，共一百零六頁。

幾個精子同時分解透明帶，但只有一個精子能穿過透明帶進入卵子內，當第一個精子進入后，透明帶的穿透性就立即發(fā)生變化，從而阻止其他精子穿越透明帶。4.穿過透明帶：1)精子穿越放射冠和透明帶頂體反應使頂體內的酶釋放出來并溶解放射冠內的卵丘細胞透明帶反應是防止多精入卵受精的第一道屏障2)精子進入卵黃膜卵黃膜封閉作用是防止多精入卵受精的第二道屏障第二十頁，共一百零六頁。5.精卵融合過程

（受精過程）a.頂體反應后，精子穿過透明帶進入卵周隙b.以赤道段與卵質膜相融合c.融合后CGs胞吐，核開始去致密d.精子頭部完全入卵，將一部分卵質膜帶入。第二十一頁，共一百零六頁。

精子進入卵子后,其細胞核變大到和卵子細胞核相似,精子細胞核(雄原核)和卵子細胞核(雌原核)同時向細胞中部靠攏,并相互融合成一個細胞核,這時稱受精卵。6.形成受精卵：第二十二頁，共一百零六頁。精、卵相遇頂體反應頂體酶釋放頂體酶溶解透明帶接觸透明帶穿越放射冠溶解卵丘細胞（放射冠）穿越透明帶接觸卵黃膜產生透明帶反應形成第一道屏障精子被微絨毛抱合精子外膜與卵黃膜融合精子進入卵第二十三頁，共一百零六頁。7.卵子的激活精子一旦與卵子接觸，卵子本身就開始發(fā)生一系列深刻的變化，即卵子的激活。卵子激活時，皮層顆粒首先于接觸點發(fā)生破裂，然后波及整個卵子的皮層，發(fā)生皮層反應。皮層顆粒內含物被排出，一部分與卵外的卵黃膜一起形成受精膜，防止多精受精。另一部分留在卵子和受精膜間的卵周隙中，吸收水分，結果使受精膜逐漸與卵子分開而舉起。皮層顆粒排放出的粘多糖形成一種粘性的透明膜物質，與卵表面緊密相粘，作用是保持隨后的分裂球聚集在一起。第二十四頁，共一百零六頁。8.多精受精的阻止1）透明帶反應，在皮層反應后，由于皮層顆粒內物質釋放到透明帶表面，卵質膜發(fā)生了重組，破壞了精子受體，其它精子不能再與透明帶結合。2）皮質反應后產生受精膜。第二十五頁，共一百零六頁。9.原核變化及融合精子進入卵內后，精子核膨大，核膜由于泡狀化而破裂，并分散在卵細胞質中，其中的染色質也由致密狀態(tài)開始松散而成為顆粒或細絲狀，逐漸形成雄原核。卵子細胞核在完成兩次減數分裂后，染色體首先分散，沿著分散的染色體的邊緣匯集了一些小囊，逐漸融合形成一雙層包膜，從而形成了一些內含染色體的小囊，即染色體泡。然后，它們相互接近，包膜彼此合并成為一個不規(guī)則的雌原核。雌、雄原核移向卵的中央，相遇，核膜消失，染色體彼此混雜在一起，從而使配子的單倍體恢復成為合子的雙倍體。受精完成。第二十六頁，共一百零六頁。精子進入卵后變化①變化②變化③產生卵黃膜封閉作用形成第二道屏障尾部脫離核膜破裂形成雄原核形成雌原核激活卵子完成減數第二次分裂，排出第二極體發(fā)育移動接觸合并形成受精卵第二十七頁，共一百零六頁。受精和胚胎發(fā)育全過程第二十八頁，共一百零六頁。（三）動物胚胎發(fā)育及其分子機制精子和卵子經過受精作用形成受精卵，受精卵經過卵裂、形成囊胚，囊胚進一步發(fā)育進入原腸胚階段，形成不同胚層，再產生器官原基，進一步產生個體。第二十九頁，共一百零六頁。哺乳動物胚胎發(fā)育的基本過程受精卵卵裂期桑椹胚囊胚（內含囊胚腔）原腸胚（內含原腸腔）胚層分化形成胎兒形成：在透明帶內進行有絲分裂，細胞數量不斷增加，但胚胎總體積并不增加，或略有減少。：由具有全能性細胞構成，細胞數在32個左右，排列緊密，形似桑椹內細胞團：發(fā)育成胎兒各組織滋養(yǎng)層細胞：發(fā)育成胎膜和胎盤：最初發(fā)育在輸卵管進行有絲分裂滋養(yǎng)層外胚層中胚層內胚層原腸腔胚胎發(fā)育：指受精卵發(fā)育成幼體的過程第三十頁，共一百零六頁。胚胎發(fā)育1.卵裂：合子發(fā)生分裂形成無數小細胞。卵裂細胞不生長而連續(xù)分裂。主要是卵裂球的有絲分裂器與表層胞質變化的過程。2.桑椹胚：卵裂數次后，出現實心細胞團，形似桑椹得名第三十一頁，共一百零六頁。強調：卵裂期的特點細胞分裂方式為_______細胞數目____胚胎總體積_____或略有___每個細胞體積_____DNA數目_____有機物總量_____有絲分裂增加不增加縮小減小增加增加第三十二頁，共一百零六頁。胚胎發(fā)育3.胚泡：哺乳動物的胚胎處于16細胞期的桑椹期時，胚胎是球型細胞團，細胞之間形成充滿液體的腔隙，然后它們聯合形成一個大腔位于胚胎的一端，即為胚泡結構。4.囊胚：桑椹胚隨著卵裂出現充滿液體的囊胚腔，圍繞囊胚腔的細胞組成囊胚層5.原腸胚：囊胚繼續(xù)發(fā)育、分化，形成雙胚層或三胚層的原腸胚。外層為外胚層、遷到里面的稱為內胚層和中胚層。第三十三頁，共一百零六頁。哺乳動物胚泡著床6.內細胞團：在胚泡胚極一端，能夠發(fā)育成為胚胎主體的一團細胞7.滋養(yǎng)層細胞：外層發(fā)育成為胎盤的細胞。8.著床：胚泡和子宮壁相互接觸并侵入子宮組織的過程。第三十四頁，共一百零六頁。第三十五頁，共一百零六頁。二、體外受精（invitrofertilization，IVF）

就是將哺乳動物卵母細胞從母體取出，在體外進行精卵結合的過程。由于體外受精在實驗室進行，所以得到的動物或人稱為“試管動物”或“試管嬰兒”。第三十六頁，共一百零六頁。第三十七頁，共一百零六頁。（一）體外受精的研究歷史1951年Chang（張明覺）和Austin發(fā)現了精子的獲能現象，為體外受精的實現打開了通路。1954年，Thibault等獲得第一只體外受精的兔子。隨著研究深入，試管老鼠、試管豬、試管牛等相繼產生。1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“試管嬰兒”，至此，體外受精技術逐漸成熟。第三十八頁，共一百零六頁。試管小鼠(Whit-tingham，1968)大鼠(Toyoda和Chang，1974)嬰兒(Steptoe和Edwards，1978)牛(Brackett等，1982)山羊(Hamda，1985)綿羊(Hanada，1985)豬(Chang等，1986)牛（Parrish等，1986）第三十九頁，共一百零六頁。

（二）體外受精技術

主要包括以下幾個主要方面：精子的采集與獲能、卵母細胞的采集及成熟培養(yǎng)、體外受精、受精卵的體外發(fā)育及試管胚胎的移植等。第四十頁，共一百零六頁。采集良種母牛的卵母細胞卵母細胞的體外培養(yǎng)采集良種公牛精子精子體外獲能體外受精良種牛體外受精胚胎胚胎移植受體牛良種犢牛成熟期牛屠宰加工廠市場采集卵巢中的卵母細胞“試管?！惫S化生產的技術流程圖第四十一頁，共一百零六頁。1.卵母細胞的采集和成熟培養(yǎng)

體外受精技術（1）卵母細胞的采集

①超數排卵

②從活體卵巢中采集卵母細胞

③從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細胞（2）卵母細胞的選擇（3）卵母細胞的成熟培養(yǎng)第四十二頁，共一百零六頁。（1）卵母細胞的采集

①超數排卵:如果一次要獲得多個卵，可以利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個過程就稱為超數排卵（superovulation）.如在小鼠Ⅳ－Ⅴ期涂片相時注射5－10IUPMSG(血清促性腺激素)，48－50小時后，再于皮下或腹腔注射5－10IUhCG(人體絨膜促性腺激素)，這種方法可以獲得超數排卵。第四十三頁，共一百零六頁。②從活體卵巢中采集卵母細胞以鼠為例：為防止干燥可將屠殺后取出的輸卵管放在平皿內，用石蠟油覆蓋，在實體顯微鏡下找到輸卵管膨部，用磨尖的鐘表鑷子，切開輸卵管膨大部，從內容物溢出而找到卵。對于稍大一些的動物可以用活體輸卵管采卵，腹部正中線切開，找出子宮角和輸卵管。利用逆向沖卵法，自子宮輸卵管連接處插入注射針，傘部以平皿接著沖洗；或在子宮輸卵管連接處下1cm處，剪成V形小口，插入塑料細管，自傘部輸卵管腹腔口插入，將液體推入，得到沖出的卵。第四十四頁，共一百零六頁。第四十五頁，共一百零六頁。第四十六頁，共一百零六頁。③從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細胞可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手術后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。對人而言通常在超數排卵步驟處理后，用B超檢測卵巢表面卵泡發(fā)育情況，然后，在腹腔后部體壁進行局部麻醉，將腹腔鏡鏡插管插入，以觀察卵巢表面卵泡成熟情況，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵針將卵吸出，放平皿中檢查。第四十七頁，共一百零六頁。（2）卵母細胞的選擇采集的卵母細胞絕大部分與卵丘細胞形成卵丘卵母細胞復合體（cumulusoocytecomplesxCOC）。無論采用何種方法，采集的COC都要求卵母細胞形態(tài)規(guī)則，細胞質均勻，外圍有多層卵丘細胞緊密包圍。常把未成熟卵母細胞分為A、B、C和D四個等級。A級卵母細胞：有三層以上卵丘細胞緊密包圍，細胞質均勻；B級卵母細胞：質均勻，卵丘細胞層低于三層或部分包圍卵母細胞；C級為沒有卵丘細胞包圍的裸露卵母細胞；D級是死亡或退化的卵母細胞。在體外受精實踐中，一般只培養(yǎng)A級和B級卵母細胞。第四十八頁，共一百零六頁。（3）卵母細胞的成熟培養(yǎng)超數排卵采集的卵母細胞已在體內發(fā)育成熟，不需培養(yǎng)可直接與精子受精；對未成熟卵母細胞需要在體外培養(yǎng)成熟。目前普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常采用微滴培養(yǎng)法，微滴體積為50-200微升，每滴中放入的卵母細胞數按每5微升一個計算單位。卵母細胞移入小滴后，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為39℃、100%濕度和5%二氧化碳的空氣。牛的培養(yǎng)時間為20-24小時；第四十九頁，共一百零六頁。2.精子的獲能處理

張明覺Austin1951年發(fā)現兔子和大白鼠直接排出的精子不能使卵受精，必須在生殖道中停留一段時間后才具備受精能力，這一現象稱為精子的獲能（capacitation）。

第五十頁，共一百零六頁。

A.精子的獲能過程，包括兩個階段，獲能的第一階段是脫出精子表面的抗原物質和去能因子，增強了膜通透性。第二階段是精子細胞膜蛋白變化，即發(fā)生頂體反應。第五十一頁，共一百零六頁。B.生育意義①去除精子表面的覆蓋物，暴露出精子膜表面與卵子相識別的位點。②增加精子活力，改變膜的通透性。③精子頭部出現流動性不相等的區(qū)域，為精子膜與頂體膜融合做好準備。④精子頂體后區(qū)膜的流動性加大，以準備與卵膜結合。第五十二頁，共一百零六頁。C.處理方法（1）培養(yǎng)法：對嚙齒動物、家兔和豬等動物，將取自附睪的精子，放入人工配制的獲能液中，培養(yǎng)一段時間后，精子就可獲能，這種方法稱為培養(yǎng)法。（2）化學誘導法：對于牛、羊等家畜，將精子放在一定濃度的肝素或鈣離子載體A23187溶液中，用化學藥物誘導精子獲能，稱之為化學法。第五十三頁，共一百零六頁。3.體外受精

（1）常規(guī)體外受精技術將獲能精子與成熟卵子置于受精液中共同培養(yǎng)，使之完成受精過程。通常情況下，受精液與獲能液為同一種液體。（2）與分離精子相結合的體外受精技術將精子分離技術與體外受精技術結合起來生產預選性別的優(yōu)良胚胎,對加速家畜品種改良和畜牧業(yè)生產具有重要的應用價值。（3）顯微受精技術為了提高體外受精的成功率，借助顯微操作儀將精子直接注入卵母細胞質或透明帶下，完成受精過程。顯微受精技術避免了由透明帶或卵質膜所形成的受精障礙，使受精率和準確率大大提高。第五十四頁，共一百零六頁。4.受精卵的體外培養(yǎng)

受精卵需要在培養(yǎng)液或輸卵管中發(fā)育到桑葚胚或囊胚階段，移植到受體后才能獲得較高的妊娠率。但體外受精的早期胚胎在體外發(fā)育過程中，往往會停滯在某一階段不再發(fā)育，此現象稱之為“發(fā)育阻滯”。不同動物體外發(fā)育阻滯出現的時期不同，小鼠為2細胞期，大鼠為8細胞期，牛和綿羊為8~16細胞，豬為4細胞期。

第五十五頁，共一百零六頁。目前，克服阻滯現象主要采用以下兩個方法：

一是改進培養(yǎng)液成分，改善培養(yǎng)條件，盡量滿足早期胚胎發(fā)育所需物質，確定并減除對其發(fā)育不利的成分；二是利用體細胞共同培養(yǎng)體系，以提供發(fā)育所需的物質條件，目前廣泛采用的有輸卵管上皮細胞共培養(yǎng)體和顆粒細胞單層共培養(yǎng)體系。

第五十六頁，共一百零六頁。5.體外受精的意義◆可以用來研究受精機理；◆治療人類男性和動物的生殖不育；◆可以利用體外受精卵的發(fā)育狀況或染色體核型檢測用來檢測形態(tài)不正常精子其染色體是否正常；◆可以產生大量的轉基因動物；◆可以簡化煩雜的凍精技術，或許只保存核物質，就可以達到受精的目的，這對保護珍貴的動物資源，將起到重要的作用。第五十七頁，共一百零六頁。三、胚胎移植技術

所謂胚胎移植（embryotransfer）也稱受精卵移植，是指將良種母畜配種后，從其生殖道（輸卵管或子宮角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同種生理狀態(tài)相同的母畜體內，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個體技術。第五十八頁，共一百零六頁。（一）胚胎移植的研究歷史1.初級階段：1900-1950主要由英美科學家在家兔、綿羊、山羊小家畜方面研究，成功率35%左右。2.發(fā)展階段：1950-1970日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手術法移植成功。胚胎移植成功率達70-80%。3.實用化初始階段：1970-1980加美開始成立牛胚胎移植公司，1973年牛凍胚移植成功（英）。1982-大規(guī)模胚胎移植、核移植、嵌合體、胚胎分割、性別鑒定、體外受精在英美日德廣泛開展?？寺⊙蛘Q生。第五十九頁，共一百零六頁。1．供體、受體的選擇胚胎移植的供體一般是選擇需要加速繁殖的有較大生產應用價值的健康的優(yōu)良畜種，受體則是繁殖能力較強的健康本地品種。（二）胚胎移植技術第六十頁，共一百零六頁。2．超數排卵第六十一頁，共一百零六頁。3．同步發(fā)情

同期發(fā)情又稱同步發(fā)情，就是利用某些激素制劑人為地控制并調整一群母畜發(fā)情周期的進程，使之在預定時間內集中發(fā)情。第六十二頁，共一百零六頁。4．人工受精激素注射結束后，觀察到發(fā)情后１２小時，開始第一次輸精，時隔１２小時進行第二次輸精，輸精量是常規(guī)量的兩倍。第六十三頁，共一百零六頁。5．胚胎采集（1）手術法：在配種或輸精后第7天，用特制的沖卵裝置，把供體母牛子宮內的胚胎沖洗出來。

第六十四頁，共一百零六頁。手術法采胚第六十五頁，共一百零六頁。（2）非手術法

第六十六頁，共一百零六頁。第六十七頁，共一百零六頁。6．胚胎的檢查與鑒定1）檢卵：37度沖卵液靜止觀察胚胎質量。

2）吸卵：注射器或吸卵管。3）胚胎質量鑒定：卵裂球外形整齊，大小一致，分布均勻，外膜完整，無卵裂及異常卵不用于移植。7．胚胎移植1）手術移植：非排卵側子宮角，通過注射器或移卵管刺入子宮角前端，注入胚胎。

2）非手術移植：采用空氣隔絕的裝有胚胎的吸管，裝入移植槍，通過子宮頸插入子宮角深部，注入胚胎。第六十八頁，共一百零六頁。顯微鏡下的胚胎第六十九頁，共一百零六頁。

所謂胚胎分割（embryosplitting）即是將一枚胚胎用顯微手術的方法分割成二分、四分甚至八分胚，經體內或體外培養(yǎng)，然后移植入受體中，以得到同卵雙生或同卵多生后代的技術，來自同一胚胎的后代有相同的遺傳物質，因此胚胎分割可看成動物無性繁殖或克隆的方法之一。四、胚胎分割技術第七十頁，共一百零六頁。第七十一頁，共一百零六頁。主要儀器設備顯微操作儀實體顯微儀第七十二頁，共一百零六頁。（一）選擇的胚胎:發(fā)育良好的,形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚.胚胎分割的理論基礎：細胞具有全能性第七十三頁，共一百零六頁。操作液的培養(yǎng)皿第七十四頁，共一百零六頁。第七十五頁，共一百零六頁。

分割時要注意：要將內細胞團均等分割，若不均等分割會影響分割后胚胎的恢復和進一步發(fā)育。第七十六頁，共一百零六頁。第七十七頁，共一百零六頁。（二）胚胎分割的方法（1）顯微針分割法在顯微操作儀下將胚胎固定--玻璃針切開透明帶--移出卵裂球--吹吸卵裂球使之離散--裝入預先備好的空透明帶。（2）顯微刀分割法顯微刀均分?？芭呋蛟缙谀遗?-分別裝入透明帶（3）酶軟化透明帶后顯微分割法用0.5%鏈霉蛋白酶軟化透明帶--玻璃針分割（4）酶消化去透明帶后分割法鏈霉蛋白酶去掉透明帶--分割裸胚（5）徒手分割法分割體積較大胚胎

第七十八頁，共一百零六頁。（三）胚胎分割目前存在的問題和發(fā)展前景1）胚胎分割產生的后代初生體重低；摘除透明帶處理會降低半胚的發(fā)育能力且耗時過多；切割后裝帶過程很可能使半胚的斷面細胞再次受到損傷，移植后可能導致犢?；?。2）遺傳一致性問題；不同質量的胚胎對分割成功率有較大的影響，而且不同質量胚胎分割后增加的可用胚的比率差異極顯著。3）同卵多胎的局限性。4）顯微操作器價格昂貴、操作煩瑣。5）由于分割操作者的熟練程度不同，導致胚胎分割的成功率差異顯著。因此應不斷提高操作者的技術水平，確保胚胎分割成功率。6）牛分割胚的冷凍同整胚相比，成功是比較困難的。有很多問題有待于解決。如半胚的包被、半胚裝入空透明帶；半胚的脫水、半胚的冷凍、解凍方法等。第七十九頁，共一百零六頁。五、胚胎冷凍保存技術將胚胎貯存在－196℃超低溫下長期保存的方法。這是20世記70年代試驗成功的一項新技術，是胚胎移植技術的重大突破。第八十頁，共一百零六頁。（一）胚胎冷凍保存的意義胚胎移植不受時間和地點的限制，提高了胚胎移植技術的效率；長期保存優(yōu)良母牛基因最可靠的技術措施；便于國際間交流；替代種畜引種。第八十一頁，共一百零六頁。1.滲透性：甘油、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）和DMSO等，防止溶質效應。2.非滲透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等，降低胚胎外液的冰點，減少胚胎外冰晶形成，并能促使胚胎內部的水分外流，從而最終減少胚胎內部冰晶的形成?；A液：mPBS（改良）、TCM-199、PBS、HEPES等，最常用mPBS。

（二）抗凍劑的種類及作用特點：分子量小于100，易于滲透特點：分子量大，不進入細胞第八十二頁，共一百零六頁。1.結晶變化：溫度降至冰點時，冰晶首先在胚胎外液形成。溫度、冰晶和外液的溶質濃度，迫使胚胎內部的水不斷外流，胚胎內部溶質濃度增加。2.溶質效應：降溫速度太慢，胚胎內水充分外流，溶質濃度極度增加，細胞膜的脂蛋白復合物和胞質內的一些其他功能蛋白變性，造成對胚胎的不可逆損害。3.機械效應：降溫速度過快，胚胎內部的水來不及溢出到胚胎外面而直接在胚胎內部形成冰晶，從而對胚胎造成致命的機械損傷。

（三）胚胎冷凍保存過程中的變化和損傷第八十三頁，共一百零六頁。1.常規(guī)冷凍法：“植冰”后控制降溫速度，避免過快以免胚胎內部形成大塊冰晶；避免過慢，以免胚胎過分脫水而產生溶質效應。2.超速冷凍法：非滲透性防凍劑對胚胎進行凍前脫水處理，將胚胎平衡一段時間，而后投入液氮保存。3.玻璃化冷凍法：應用高濃度防凍劑，使胚胎內外液的同源晶核形成溫度與玻璃態(tài)轉化溫度基本接近，控制防凍劑與胚胎的平衡時間和溫度，使防凍劑對胚胎毒性降低到最低程度。胚胎內外液能迅速轉化形成玻璃體，直接投入液氮保存。

（四）胚胎冷凍保存方法第八十四頁，共一百零六頁。歷史：1972年首先獲小鼠胚胎冷凍成功；

1973年牛的胚胎冷凍后獲得成功，并產下后代。操作流程：（1）抗凍液中平衡：室溫下（20～25℃），在含有1～2摩爾∕升抗凍劑的磷酸緩沖液（PBS）中，胚胎經10分鐘平衡，使細胞內部抗凍劑濃度基本達到飽和。1.常規(guī)冷凍法第八十五頁，共一百零六頁。（2）植冰（誘發(fā)結冰）：植冰的概念：在液氮中冷卻后的鑷子或棉簽夾住塑料細管上端（棉栓端），使抗凍液迅速通過－6℃左右冰點，強制性地使細胞外液形成冰晶，稱之為植冰。目的：當溫度降到抗凍液冰點附近時，經植冰迅速凍結，以防胚胎細胞內部產生冰晶，給胚胎造成物理性的損傷，致使胚胎死亡。將胚胎移入事先配置好抗凍液的0.25毫升塑料細管內封口后進行冷卻。當溫度降至－6℃左右時，用上述方法誘發(fā)結冰。1.常規(guī)冷凍法第八十六頁，共一百零六頁。（3）自動降溫儀中緩慢降溫：植冰后的細管按一定速度緩慢降溫。以0.33℃／分鐘降至－30～－35℃時投入液氮；以1.0℃／分鐘的速度降至－80℃時投入液氮；以0.5℃／分鐘降至－30～－35℃時投入液氮。原理：植冰后使細胞外液濃度相對增高，促使細胞內部水分充分脫出，因此緩慢降溫是非常必要的。由于脫水使細胞內部充分收縮，同時抗凍劑滲透到細胞內部使內部溶液黏性增大，這時投入液氮中，由于過冷抑制冰晶形成。1.常規(guī)冷凍法第八十七頁，共一百零六頁。（4）解凍：貯存在液氮中的塑料細管取出后，迅速浸入室溫或37℃水浴中解凍。（5）除去抗凍劑：原因：解凍后的胚胎，細胞內部抗凍劑濃度較高，對胚胎有毒害作用；此外，若直接移入等滲生理溶液中，水分會伸入細胞內引起膨脹，使細胞受損傷。抗凍液：蔗糖溶液；操作：解凍后胚胎由濃度高的抗凍液中移向濃度低的抗凍液，進行梯度稀釋；即將胚胎先移入高滲蔗糖溶液中，再移入低滲蔗糖溶液中，在脫水的同時脫出抗凍劑，而后移入等滲生理溶液中洗凈，待胚胎基本復原后進行移植或繼續(xù)培養(yǎng)。1.常規(guī)冷凍法第八十八頁，共一百零六頁。

從培養(yǎng)液中吸取胚胎，并放置在冷凍液中:1.5M乙二醇+蔗糖+PBS+AA+FCS

裝入細管(編號預先準備好)

放入冷凍容器-6.0℃Seedingice

每分鐘降低0.5℃，一直到-30℃為止放入液氮容器1.常規(guī)冷凍程序第八十九頁，共一百零六頁。玻璃化的概念：是一種物理現象，指通過快速降溫越過冰晶形成的階段，不發(fā)生結晶即可固化，使溶液形成一種無規(guī)則結構的穩(wěn)定玻璃樣固體，且保持液態(tài)時正常的分子和離子分布，則胚胎細胞免受損傷。

即高濃度的抗凍劑，急速冷卻后，液體的黏性增加，冰晶不能形成，由液態(tài)變?yōu)橥该靼牍虘B(tài)的現象。玻璃化溶液（VS）：細胞內液抗凍劑：這種抗凍劑分子量小，容易透過細胞膜，使其內部迅速達到玻璃化所需要的濃度，所以稱為細胞內液抗凍劑。如二甲基亞砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。細胞外液抗凍劑：這種抗凍劑分子量較大，一般很難透過細胞膜，所以稱為細胞外液抗凍劑。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。

上述兩種抗凍劑組合后，用基礎液mPBS調制成各種玻璃化溶液。3.胚胎玻璃化冷凍第九十頁，共一百零六頁。幾種常見的玻璃化冷凍方法：（1）Rall等（1985）玻璃化冷凍保存法：是最初發(fā)明的玻璃化冷凍保存方法，他們采用的VS1玻璃化溶液，是以透過性抗凍劑二甲基亞砜（DMSO）為主體溶液，為緩和其化學毒性，添加了乙酰胺(AA)、丙二醇(PG)和非透過性抗凍劑聚乙二醇(PEG)。PEG具有促進玻璃化形成的作用。胚胎在玻璃化溶液中平衡時，濃度由低到高（25％～50％～100％VS1）；平衡溫度由高到低（22～4～－4℃）三步完成，計35分鐘平衡后投入液氮中冷凍保存。3.胚胎玻璃化冷凍第九十一頁，共一百零六頁。（2）Scheffen等玻璃化冷凍保存法：主體抗凍劑：丙三醇（G）和丙二醇(P)；玻璃化溶液：上述兩種抗凍劑各含25％混合而成(PG25)，兩者混合后可降低溶液的化學毒性，無需添加細胞非透過性抗凍劑。方法：室溫下（20～25℃），胚胎于10％丙三醇溶液中平衡10分鐘，然后在PG25中平衡30秒鐘，然后投入液氮中冷凍保存。第九十二頁，共一百零六頁。（3）Kasai等玻璃化冷凍保存法：抗凍劑：乙二醇（EG）為細胞內液抗凍劑（透過性保護劑），其具備分子量小、溶液滲透壓高、細胞膜透過性強的特點；聚蔗糖（Ficoll）為細胞外液抗凍劑，有利于促進玻璃化形成；蔗糖(Sucrose)是為了冷凍前胚胎細胞的脫水，細胞內部EG的調整及解凍后的EG的脫出。玻璃化溶液：上述三種抗凍劑經mPBS調整成EFS玻璃化溶液；方法：室溫胚胎在EFS玻璃化溶液中2～5分鐘平衡后，即投入液氮。第九十三頁，共一百零六頁。（4）Zhu等玻璃化冷凍保存法：主體抗凍劑：乙二醇、甘油和二甲基亞砜；玻璃化溶液：EFS、GFS和EDFS；方法：室溫下，將胚胎在10％乙二醇或10％甘油或10％乙二醇＋10％二甲基亞砜中平衡5分鐘，再移入EFS或GFS或EDFS玻璃化溶液中平衡30秒鐘，即兩步法冷凍保存。此方法重復性較高，對實驗動物及各種家畜的胚胎皆可進行冷凍保存。第九十四頁，共一百零六頁。E546-SM4567891%2223333M198Mar,27胚胎公司冷凍編號配種編號供體母牛登記公牛登記冷凍日期直接移植胚胎號胚胎發(fā)育階段胚胎質量BetsyDT1（五）胚胎細管編號第九十五頁，共一百零六頁。第九十六頁，共一百零六頁。保護細胞膜免受損害；保護胚胎細胞，免受晶體損害；具有“滲透活性”；解凍后保護劑必須從細胞內去掉；甘油（丙三醇）：普通的冷凍和解凍劑，通過細胞膜慢慢擴散，為避免滲透休克，必須緩慢去掉；乙二醇：直接胚胎移植方法,通過細胞膜快速擴散，因而不需要慢慢去掉。（六）冷凍保存的要點第九十七頁，共一百零六頁。（七）胚胎解凍解凍方法：慢速解凍：以4-25℃/min的速率使胚胎由冷凍保存溫度逐漸升至室溫，適用于慢速冷凍的胚胎。當溫度由-196℃升到-50～-15℃埋，細胞內仍可能形成大冰晶而致死胚胎?？焖俳鈨觯簻厮》?，以30-36℃/min的速率使胚胎在30-40s內從-196℃至室溫。第九十八頁，共一百零六頁。（七）胚胎解凍脫除保護劑：目的：防止保護劑對胚胎的毒性；防止因細胞內保護劑濃度過高，導致胞內外滲透壓差過大，而使胞外水分內流，最終使胚胎過度膨脹受損。經典方法：濃度遞減的保護液逐步稀釋脫除，繁瑣費時，但有效；蔗糖等非滲透性保護液逐步脫除，使用較多；第九十九頁，共一百零六頁。六、動物的性別控制動物的性別控制技術是通過對動物的正常生殖過程進行人為干預,使成年雌性動物產出人們期望性別后代的一門生物技術；