嬰幼兒配方乳粉膽堿的測(cè)定修改說明(精)

嬰幼兒配方乳粉膽堿的測(cè)定修改說明1、任務(wù)來源、起草單位、驗(yàn)證單位和主要起草人任務(wù)來源：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)起草單位：驗(yàn)證單位：黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心。主要起草人：2、原標(biāo)準(zhǔn)中膽堿測(cè)定方法簡(jiǎn)介GB/T5413.20-1997中規(guī)定了酶比色法測(cè)定嬰幼兒食品和乳粉中膽堿的方法。該方法是等同采用AOAC的方法。自1997年GB/T5413頒布以來，我中心開展嬰幼兒配方食品和乳粉中膽堿的測(cè)定工作。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的大量試驗(yàn)，認(rèn)為酶比色法測(cè)定膽堿的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性都較好。由于該方法使用的兩種酶制劑價(jià)格昂貴、全部需進(jìn)口，且測(cè)定要求實(shí)驗(yàn)室條件較高，所以目前國(guó)內(nèi)只有個(gè)別外資與國(guó)內(nèi)幾家大型乳粉企業(yè)使用該方法測(cè)定膽堿。而絕大多數(shù)企業(yè)（包括質(zhì)檢機(jī)構(gòu)）由于受條件限制未采用此方法。2008年4月全國(guó)乳品標(biāo)準(zhǔn)化中心在哈爾濱組織召開了由多家乳品企業(yè)及質(zhì)檢機(jī)構(gòu)參加的關(guān)于GB/T5413修訂研討會(huì)上，許多專家提出：為適應(yīng)國(guó)內(nèi)目前狀況，能否增加較為操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好的化學(xué)方法—雷氏鹽比色法。我中心因在此之前已開展了對(duì)該方法的技術(shù)資料收集及方法的研究工作。會(huì)上一致決定由我中心負(fù)責(zé)起草該標(biāo)準(zhǔn)方法。2005年我中心接受了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化委會(huì)對(duì)《嬰幼兒配方食品和乳粉通用檢驗(yàn)方法》修訂的工作。在此情況下,經(jīng)多方查找資料，并進(jìn)行了大量的試驗(yàn)驗(yàn)證后，認(rèn)為雷氏鹽比色法測(cè)定膽堿是一個(gè)較為經(jīng)典、可靠的方法。該方法操作簡(jiǎn)便、測(cè)定重現(xiàn)性與再現(xiàn)性較好，不須特殊的儀器設(shè)備與試劑，一般實(shí)驗(yàn)室都具備條件，利于各乳品企業(yè)使用等特點(diǎn)。3、雷氏鹽比色法測(cè)定膽堿的必要性及意義膽堿（choline）是一種維生素，是人體所需要的重要營(yíng)養(yǎng)素。膽堿是抗脂肪肝因子，可預(yù)防脂肪沉積以肝臟中，加速脂肪進(jìn)入細(xì)胞的活動(dòng)，幫助調(diào)節(jié)肝和膽囊的功能，可預(yù)防膽結(jié)石。缺乏膽堿會(huì)引起胃潰瘍、胃出血、心臟疾病、腎管阻塞、動(dòng)脈硬化等疾病。膽堿一般以磷酸膽堿或乙酰膽堿的形式廣泛分布在卵磷脂、蛋黃、肝臟、啤酒小麥芽中。成年人可以從食物中獲取，所以成年人中尚未發(fā)現(xiàn)膽堿缺乏者。對(duì)全部依靠嬰幼兒配方乳粉提供營(yíng)養(yǎng)的嬰幼兒而言，膽堿也是必不可少的營(yíng)養(yǎng)成分之一被添加到嬰幼兒配方乳粉。作為配方成分之一，企業(yè)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控與政府部門執(zhí)法都需要建立相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。原標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定膽堿的方法為酶比色法，由于該法存在較大的局限性，受條件限制，絕大多數(shù)企業(yè)等都無法采用該方法測(cè)定膽堿。為此在標(biāo)準(zhǔn)研討會(huì)上許多代表建議增加適于企業(yè)采用且能準(zhǔn)確測(cè)定膽堿的化學(xué)方法，以利于企業(yè)等對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)控。所以增加雷氏鹽法是廣大生產(chǎn)部門及多數(shù)質(zhì)檢機(jī)構(gòu)所需，企業(yè)對(duì)確保產(chǎn)品質(zhì)量及政府執(zhí)法提供技術(shù)保障，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。制定標(biāo)準(zhǔn)的原則和依據(jù)。在所查閱的很多文獻(xiàn)中，雷氏鹽比色法測(cè)定膽堿適應(yīng)性較廣，可適用于幾乎所有的食品及添加劑等。目前在現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T17481-1998《預(yù)混料中膽堿的測(cè)定分光光度法》、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HG/T2941-2004《飼料級(jí)氯化膽堿》中，采用的就是雷氏鹽法，方法原理與本方法基本相同，只是前處理及收集雷氏鹽方法有所差異。本方法研究借鑒于《營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)》1993年6月第15卷第2期上發(fā)表的論文《嬰兒奶粉集食品中膽堿的測(cè)定》。經(jīng)過大量試驗(yàn)，進(jìn)一步完善了實(shí)驗(yàn)條件，形成了現(xiàn)在的測(cè)定方法。在本實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定膽堿的線性范圍為0-5mg/mL，線性回歸方程y=1.661400e-02+3.86303e*x；相關(guān)系數(shù)為0.9992。本方法與國(guó)標(biāo)中方法相對(duì)照得到滿意的結(jié)果。該方法與原國(guó)標(biāo)中的方法進(jìn)行了比對(duì)實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)兩方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析表明：兩者測(cè)定結(jié)果見無顯著差異。5標(biāo)準(zhǔn)主要條款的說明范圍適用于嬰幼兒配方食品和乳粉中膽堿的測(cè)定。方法原理食品中的膽堿包括游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形態(tài)，用氫氧化鋇－甲醇－氯仿混合溶液抽提水解．樣液經(jīng)過弗羅里硅藻土層析，與水解產(chǎn)物分離，在柱子上與雷納克銨鹽溶液形成粉紅色的膽堿雷納克鹽，用丙酮溶解洗脫，于526nm測(cè)定吸收值．樣品處理膽堿在奶粉及米粉樣品中主要以磷酸膽堿和乙酰膽堿的形式存在，而強(qiáng)化膽堿主要以氯化膽堿的形式存在。首先要經(jīng)過水解，水解的作用就是要使結(jié)合態(tài)的膽堿游離出來。稱取10g左右的樣品于磨口三角瓶中，加入50ml氫氧化鋇一甲醇一氯仿抽提液，上接冷凝管，在79±2°C的水浴鍋內(nèi)水解4小時(shí)，不時(shí)地?fù)u動(dòng)三角瓶，使樣品不結(jié)塊．水解溫度是樣品前處理的關(guān)鍵控制點(diǎn)，因?yàn)樗鉁囟葧?huì)直接影響水解效果。溫度過低容易使樣品水解不充分；溫度過高，又會(huì)因膽堿的不穩(wěn)定性使其分解損失，造成結(jié)果偏低。所以要嚴(yán)格控制水浴溫度，要選用恒溫控制良好的水域鍋。實(shí)驗(yàn)使用試劑膽堿標(biāo)準(zhǔn)品本實(shí)驗(yàn)使用的膽堿標(biāo)準(zhǔn)品沒有采用氯化膽堿。主要是因?yàn)槁然憠A極易吸潮，遇熱不穩(wěn)定，故采用酒石酸膽堿作標(biāo)準(zhǔn)品。酒石酸膽堿性質(zhì)穩(wěn)定，在配制使用過程中基本無變化，且含有的極少量水分，放在干燥器中2小時(shí)以上即可除去。該標(biāo)樣要現(xiàn)用現(xiàn)配。雷氏鹽雷氏鹽全名為雷納克銨鹽(AmmoniumReineckate)。該試劑要求純度要高，否則對(duì)顯色會(huì)產(chǎn)生干擾。該試劑需要現(xiàn)用現(xiàn)配。層析柱層析柱的填料為弗羅里硅藻土(60—120目),且經(jīng)過650C活化后的吸附效果好。層析柱只能一次性使用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制從1g/L的膽堿標(biāo)準(zhǔn)工作液中，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，注入層析柱中，按樣液層析步驟，收集粉紅色的膽堿雷納克鹽丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液并定溶于10ml。以丙酮為空白，在526nm處測(cè)定其吸光值。以膽堿含量為橫座標(biāo)，吸光值為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線及吸光值回歸方程與相關(guān)系數(shù)膽堿含量mg0.991.982.973.964.95吸光值0.05380.09580.12840.17180.207回歸方程y=1.661400e-02+3.86303e*x相關(guān)系數(shù)Ff=0.999230由此可見在一定膽堿濃度為0-5mg/mL內(nèi)符合比爾定律。5.6結(jié)果分析與計(jì)算通過從工作曲線上查得樣液中膽堿的含量，可計(jì)算出試樣中膽堿的含量。注意若以酒石酸膽堿作來來表示標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度時(shí)，與膽堿的換算系數(shù)為0.474。即最終結(jié)果應(yīng)以膽堿表示。5.7最低檢出險(xiǎn)根據(jù)GB/T5009.1-2003,中A2.2吸光法和熒光法中的計(jì)算方法。計(jì)算檢出限:TXl—看Ks=-b―二T式中：b—標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中的斜率。s—二次空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；K一根據(jù)一定置信度確定的系數(shù)，按3計(jì)算。確認(rèn)試樣檢出限為5mg/100g。5.8準(zhǔn)確度的計(jì)算為了確定本方法的準(zhǔn)確度，根據(jù)GB/T5009.1-2003,我們選用了三個(gè)不同水平的奶粉樣品作回收率試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室水平本底值(mg/100g)添加量(mg)實(shí)測(cè)值(mg)回收率(Mg)平均回收率(Mg)國(guó)家乳制品質(zhì)水平152.261010.51105.1量監(jiān)督檢驗(yàn)中水平260.351514.3595.6798.80心水平370.123028.6995.636實(shí)驗(yàn)室間方法驗(yàn)證由于本標(biāo)準(zhǔn)含蓋了嬰幼兒配方方食品和奶粉,所以我中心根據(jù)方法驗(yàn)證要求,分別制備嬰幼兒配方奶粉與嬰幼兒配方米粉各三個(gè)水平的樣品供實(shí)驗(yàn)間方法驗(yàn)證。由于時(shí)間關(guān)系,只有兩家實(shí)驗(yàn)室參加其驗(yàn)證工作：青島圣元營(yíng)養(yǎng)乳品有限公司中心實(shí)驗(yàn)室與國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心。驗(yàn)證結(jié)果如下：6.1實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度青島圣元營(yíng)養(yǎng)乳品有限公司中心實(shí)驗(yàn)室膽堿測(cè)定結(jié)果

奶粉米粉123456185.1692.9652.68122.5893.5570.82286.5295.7454.15118.5093.0773.15383.8093.0151.22126.6594.0370.11483.4494.1853.58124.6895.1871.56582.1891.8752.77120.8692.8869.87687.2590.1754.02119.9894.7571.06平均值84.7392.9953.07122.2193.9171.10標(biāo)準(zhǔn)偏差1.941.911.093.050.921.18相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差％2.292.052.052.500.981.66國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心膽堿測(cè)定結(jié)果編號(hào)水平奶粉米粉123456187.1990.0150.35125.6895.2570.82289.2292.3050.36123.1593.2967.98384.4091.1453.00125.3594.9371.81487.1292.3252.05126.9898.8566.96586.0090.8549.06127.0297.8169.97688.3592.2148.02129.6599.7965.56平均值87.0591.4750.47126.3196.6568.85標(biāo)準(zhǔn)偏差1.710.961.842.162.542.41相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差％1.961.053.651.712.623.506.2精密度的計(jì)算6.2.1測(cè)試結(jié)果一致性和離群值的檢驗(yàn)

（依據(jù)GBT6379.2-2004《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度第2部分確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》計(jì)算。從以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室的八個(gè)數(shù)據(jù)中取前六個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。表1膽堿測(cè)定原始數(shù)據(jù)mg/100g實(shí)驗(yàn)室測(cè)定次數(shù)水平123456青島圣兀營(yíng)養(yǎng)乳品有限公司中心實(shí)驗(yàn)室（1）185.1692.9652.68122.5893.5570.82286.5295.7454.15118.5093.0773.15383.8093.0151.22126.6594.0370.11483.4494.1853.58124.6895.1871.56582.1891.8752.77120.8692.8869.87687.2590.1754.02119.9894.7571.06國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（2）187.1990.0150.35125.6895.2570.82289.2292.3050.36123.1593.2967.98384.4091.1453.00125.3594.9371.81487.1292.3252.05126.9898.8566.96586.0090.8549.06127.0297.8169.97688.3592.2148.02129.6599.7965.56表2 膽堿含量的單元平均值 （mg/100g）實(shí)驗(yàn)室i水平j(luò)奶粉米粉123456y..丿ijn..ijy..丿.jn..ijy..丿ijn..ijy..丿.jn..ijy..丿.jn..ijy..丿.jn..ij184.73692.99653.076122.21693.31671.106287.05691.47650.476126.31696.65668.856表3膽堿含量的標(biāo)準(zhǔn)差實(shí)驗(yàn)水平j(luò)奶粉米粉

室i123456S..1Jn..iJs..iJn..iJs..iJn.ijs..iJn..iJs..iJn..iJs..iJn..iJ11.9461.9161.0963.0560.9261.18621.7160.9661.8462.1662.5462.416用柯克倫檢驗(yàn)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是否有歧離值和離群值。根據(jù)GB/T6379.2—0047.3.2.1中的規(guī)定：——如果檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量小于或等于5%臨界值，則接受檢驗(yàn)的項(xiàng)目為正確值；——如果檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量大于5%臨界值，，但小于或等于1%臨界值，則稱被檢驗(yàn)的項(xiàng)目為歧離值。但可參與計(jì)算?！绻麢z驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量大于1%的臨界值，則被檢驗(yàn)的項(xiàng)目稱為立群值。予以剔除。在本實(shí)驗(yàn)中，P=2,n=6柯克倫檢驗(yàn)1%臨界值為0.937, 5%臨界值為0.877。s2柯克倫檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量： C=max才s：ii=1表4柯克倫統(tǒng)計(jì)量計(jì)算值：水平工S2iS2i實(shí)驗(yàn)室柯克論統(tǒng)計(jì)量16.68773.7636實(shí)驗(yàn)室10.56324.56973.6481實(shí)驗(yàn)室10.79934.57373.3856實(shí)驗(yàn)室20.738413.96819.3025實(shí)驗(yàn)室10.66557.29806.4516實(shí)驗(yàn)室20.88467.20055.8081實(shí)驗(yàn)室20.807由此可知只有水平5實(shí)驗(yàn)室2的數(shù)據(jù)為歧離值，其它檢驗(yàn)數(shù)據(jù)均為正確值，均可參與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。6.2.2m.，s和s的計(jì)算jrjRj6.2.2.1總平均值m的計(jì)算以水平1為例水平1：m=yjjYnyijij4 =85.89Yniji=16.2.2.2方差的計(jì)算根據(jù)GB/T6379.2-2004中7.4.4和7.4.5中所定義的諸方差計(jì)算以水平1為例：Yp(n-1)S2重復(fù)性方差：S2重復(fù)性方差：S2=

rji=1 =3.344Y(n-1)ij

i=1實(shí)驗(yàn)室間方差：S2ljS2djS2-S2ljS2djS2-S2=―dj jnj=丄Y

p-1i=1nij(y-y2=16.147iji1n=—jp-1niji=1Yn2ij-4=1 Yniji=1=6S2=I6」47一彳344=2.134

lj重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差S重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差S=1.829r再現(xiàn)性方差：S2=S2+S2=3.344+2.134=5.478Rjrjlj再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差S=2.341Rj依次對(duì)水平2、3、4、5、6進(jìn)行計(jì)算，其結(jié)果見表5。。6.2.3精密度與m的關(guān)系表5樣品中的膽堿含量m,S和SRj的值128