PCR常見問題分析報告及對策

有用標準文檔有用標準文檔問題問題2：非特異性擴增現(xiàn)象：條帶與估量的大小不全都或者非特異性擴增帶緣由：1.引物特異性差2.模板或引物濃度過高問題1：無擴增產(chǎn)物現(xiàn)象：正比照有條帶，而樣品則無緣由:模板:含有抑制物，含量低Buffer引物設計不當或者發(fā)生降解反響條件：退火溫度太高，延長時間太短對策:純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量Buffer重設計引物〔避開鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級構(gòu)造〕或者換一管引物降低退火溫度、延長延長時間酶量過多退火溫度偏低現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。緣由：1.模板不純2.Buffer3.退火溫度偏低4.酶量過多5.dNTP、Mg+度偏高循環(huán)次數(shù)過多對策：PCR適當降低模板或引物濃度適當削減酶量降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用二階段溫度法削減循環(huán)次數(shù)問題3：拖尾6.循環(huán)次數(shù)過多對策：純化模板更換Buffer適當提高退火溫度適量用酶dNTP削減循環(huán)次數(shù)問題4：假陽性現(xiàn)象：空白比照消滅目的擴增產(chǎn)物緣由：靶序列或擴增產(chǎn)物的交*污染對策：操作時應留神輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，全部試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。各種試劑最好先進展分裝，然后低溫貯存PCR一般為48h以內(nèi)，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)章甚致消逝。假陰性，不消滅擴增條帶PCR④PCR模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有TaqTaq引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要留意引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，確定要有引物條帶消滅，而且兩引物帶的亮度應大體全都，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2Mg2+PCRPCRPCRPCR反響體積的轉(zhuǎn)變：通常進展PCR20ul、30ul、50ul100ul，PCR20ul后，再做大體積時，確定要模索條件，否則簡潔失敗。火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延長溫度，這也是PCR失敗的緣由之一。PCR假陽性PCR引物設計不適宜：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進展PCRPCRPCRPCR消滅非特異性擴增帶Mg2PCR(93℃變性，65℃左右退火與延長)。消滅片狀拖帶或涂抹帶PCRdNTPMg2+濃度。④增加模板量，削減循環(huán)次數(shù)。PCR最正確插入片段：載體比需試驗確定。1：1〔插入片段：載體〕1：88：15ul2X50ng粒DNA,1Weiss單位的T410ul14oC2種溫度下，缺T-1小時4oCPCR比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。假設沒有回收到目的片段，還需要作什么比照試驗？A〕涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞。如有菌落，說明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。B〕轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul1:100,1ul100ulSOC1000ul100ul鋪板。培育過夜，產(chǎn)生1000/DNADNA10ngSOC1000u10ngDNA，1/101ngDNA。轉(zhuǎn)化率為：1000X10〔3〕ng/1ngDNAug=10〔6〕cfu/ug10〔8〕cfu/ug>20-40〔10〔8〕cfu/ug〕，T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4DNA〔M1801，M1804，M1794〕T4DNApGEM-TEasypGEM-T〔10〔8〕cfu/ug〕,10060%應為白斑，如產(chǎn)生>20-40比照試驗結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，試驗出了什么問題？4oC3`-TpGEM-TpGEM-TpGEM-TEasy3`-TUV過度照耀，時有發(fā)生。UV過度照耀會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重純化。D〕DNAA，pGEM-TpGEM-TEasyTaqDNAA。詳情查pGEM-TpGEM-TEasy載體技術(shù)資料〔TM042〕。SUREPCRPCR0.2-mlPCRdNTPPCRTaqPCR沒有擴增產(chǎn)物：MgCl20.25mmol/LMgCl2MgCl20.5mmol/LMgCl2MgCl2，PCRMg2+。檢查退火溫度和變性條件，假設有需要的話，可降低退火溫度。檢查模板和引物的用量。泳道中消滅模糊條帶：重設計引物或設計更長的引物。其他值得留意的條件：建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時不能有效地使模板變性。大多數(shù)反響中，0.75ml〔0.5~1ml〕的酶量在大多數(shù)狀況下可以得到滿足的結(jié)果。建議使用1.75mmol/LMgCl2∶350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2∶500mmol/LdNTP組合的混合物。然而要得到最正確結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的?；蚪MDNAPCRDNADNADNA10kbDNADNA降低二級構(gòu)造和引物二聚物形成的可能性。進展長片段PCR擴增時，引物長度一般為24~34個核苷酸，溶點在60~68℃間。使用這類引物可提高PCR反響的退火溫度來增加反響的特異性。這點格外重要，長片段擴增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴增的影響。94℃294℃20--30GC，95℃30DNADNA12kb下進展延長操作。循環(huán)延長：盡量承受循環(huán)延長的條件，假設PCR儀無此功能，則必需增加延長的時間，例如在擴增10kb片斷時，延長時間用10分鐘替代原來的8分鐘。長片斷PCR系統(tǒng)擴增的片斷其3’-末端帶有一個突出的A，因此建議承受T/A克隆。假設要進展平端可隆，可用Klenow酶和T4DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補平后再進展。Sanger〔染色體〕帶型。引物設計：一般長度20-30bp；避開引物二聚體和二級構(gòu)造；也可以以下圖示提示找到解決問題的突破口：PCR0.5ml0.2ml(μl)終濃度129.410×BufferB251×4×dNTP35200μmol/LMgCl2431.5mmol/L52.60.25μmol/L62.60.25μmol/L720.1μgTaqDNA80.41unit用微量可調(diào)加樣器和一次性Tip向每一管中加50μl礦物油。每加一管換一次Tip。振蕩每只管，然后短暫離心。94℃4194℃172℃1304℃60-80V,15-20紫外檢查電泳結(jié)果。四、爭論假陰性，不消滅擴增條帶PCRPCRDNA酶失活：需更換酶，或舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不抱負、簡潔彌散的常見緣由。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條ODPCR決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止屢次凍融或長期放冰箱冷藏，導致引物變質(zhì)降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+M2+PCRPCRPCRPCR反響體積的轉(zhuǎn)變：通常進展PCR擴增承受的體積為20ul、30ul、50ul、或100ul，應用多大體積進展PCR擴增，是依據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，20ul后，再做大體積時，確定要模索條件，否則簡潔失敗。PCRPCR失敗的緣由之一。PCR假陽性PCRPCRPCR簡潔消滅假陽性。需重設計引物。PCRPCR消滅非特異性擴增帶PCR擴增后消滅的條帶與估量的大小不全都，或大或小，或者同時消滅特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的消滅，其緣由：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易消滅非特異(93℃變性，65℃左右退火與延長)。4.消滅片狀拖帶或涂抹帶，dNTP，Mg2+dNTPMg2+濃度。④增加模板量，削減循環(huán)次數(shù)。TroubleshootingforPCRandmultiplexPCRCOMPONENTVOLUMECOMPONENTVOLUMEFINALCONCENTRATION1.autoclavedultra-filteredwater(pH7.0)20.7μL-2.10xPCRBuffer*2.5μL1x3.dNTPsmix(25mMeachnucleotide)0.2μL200μM(eachnucleotide)4.primermix(25pmoles/μLeachprimer)0.4μL0.4μM(eachprimer)5.TaqDNApolymerase(nativeenzyme)0.2μL1Unit/25μL6.genomicDNAtemplate(100ng/μL)1.0μL100ng/25μL*The10xPCRbuffercontains:500mMKCl;100mMTris-HCl(pH8.3);15mMMgCl(thefinalconcentrationsoftheseingredientsinthePCRmix2are:50mMKCl;10mMTris-HCl;1.5mMMgCl2).QUESTIONS SOLUTIONSIget(many)longerunspecifiDecreaseannealingtimeproducts.WhatcanIdo? temperatureDecreaseextensiontimeDecreaseextensiontemperatureto62-68oCIncreaseKCl(buffer)concentrationto1.2x-2x,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mM.IncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.TakelessprimerTakelessDNAtemplateTakelessTaqpolymeraseIfnoneoftheaboveworks:checktheprimerforrepetitivesequences(BLASTalignthesequencewiththedatabases)andchangetheprimer(s)Combinesome/alloftheaboveIget(many)shorterunspecificIncreaseannealingtemperatureproducts.WhatcanIdo? IncreaseannealingtimeIncreaseextensiontimeIncreaseextensiontemperatureto74-78oCDecreaseKCl(buffer)concentrationto0.7-0.8x,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mMIncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstantTakelessprimerTakelessDNAtemplateTakelessTaqpolymeraseIfnoneoftheaboveworks:checktheprimerforrepetitivesequences(BLASTalignthesequencewiththedatabases)andchangetheprimer(s)Combinesome/alloftheaboveReactionwasworkingbefore,MakesureallPCRingredientsaretakeninthereaction(buffer,butnowIcan”tgetanyproduct.template,Taq,etc)ChangethedNTPsolution(verysensitivetocyclesofthawingandfreezing,especiallyinmultiplexPCR)Ifyoujustboughtnewprimers,checkfortheirreliability(badprimersynthesis?)IncreaseprimeramountIncreasetemplateamountDecreaseannealingtemperatureby6-10oCandcheckifyougetanyproduct.Ifyoudon”t,checkallyourPCRingredients.Ifyoudogetproducts(includingunspecificones)reactionconditionsasdescribedabove.Combinesome/alloftheaboveMyPCRproductisweak.IsthereGraduallydecreasetheannealingtemperaturetothelowestpossible.awaytoincreasetheyield? IncreasetheamountofPCRprimerIncreasetheamountofDNAtemplateIncreasetheamountofTaqpolymeraseChangebuffer(KCl)concentration(higherifproductislowerthan1000bporlowerifproductishigherthan1000bp)Addadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8μg/μLfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerol.Checkprimersequencesformismatchesand/orincreasetheprimerlengthby5nucleotidesCombinesome/alloftheaboveMytwoprimershavevery AneasysolutionistoincreasethelengthoftheprimerwithlowdifferentmeltingtemperaturesTm.Ifyouneedtokeepthesizeoftheproductconstant,addafew(Tm)butIcannotchangetheirbasesatthe3”end.Ifsizeisnotaconcern,addafewbasesatlocus.WhatcanIdotoimprovePCReitherthe3”orthe5”endofthatprimer.amplification?IhaveanumberofprimerpairsVerylikely,yes.Iwouldliketousetogether.CaTryamplifyalllociseapratelyusingthesamePCRprogram.IfoneIrunamultiplexPCRwiththem?oftheprimerpairsyieldsunspecificproducts,keepthecyclingHow? conditionsconstantandchangeotherparametersasmentionedabove(#1and#2).Mixequimolaramountsofprimersandrunthemultiplexreactioneitherinthesamecyclingconditionsorbydecreasingonlytheannealingtemperatureby4oC.Ifsomeofthelociareweakornotamplified,readbelow!!HowmanylocicanIamplifyiDifficulttosay.Theauthorhasroutinelyamplifiedfrom2to14multiplexPCRatthesametime?loci.Literaturedescribesupto25lociorso.OneorafewlociinmymultiplexThefirstchoiceshouldbeincreasingtheamountofprimerforthereactionareveryweakor “weak“l(fā)ociatthesametimewithdecreasingtheamountofprimerinvisible.Howcanamplifythem?foralllocithatcanbeamplified.Thebalancebetweentheseamountsismoreimportantthantheabsolutevaluesused!!.Checkprimersequencesforprimer-primerinteractionsShortPCRproductsinmy IncreaseKCl(buffer)concentrationto1.2x-2x,butkeepMgCl2multiplexreactionareweak.Howconcentrationat1.5-2mMcanIimprovetheiryield? DecreasedenaturingtimeDecreaseannealingtimeandtemperatureDecreaseextensiontimeandtemperatureIncreaseamountofprimersforthe“weak“l(fā)ociwhiledecreasingtheamountforthe“strong“l(fā)oci.Addadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8μg/μLfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerolCombinesome/alloftheaboveLongerPCRproductsinmy DecreaseKCl(buffer)concentrationto0.7-0.8x,butkeepMgCl2multiplexreactionareweak.Howconcentrationat1.5-2mMcanIimprovetheiryield? IncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.IncreasedenaturingtimeIncreaseannealingtimetemperatureIncreaseextensiontimeandtemperatureIncreaseamountofprimersforthe“weak“l(fā)ociwhiledecreasingtheamountforthe“strong“l(fā)ociAddadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8μg/μLfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerolCombinesome/alloftheaboveAllproductsinmymultiplexDecreaseannealingtimeinsmallsteps(2oC)reactionareweak.HowcanI Decreaseextensiontemperatureto62-68oCimprovetheyield? IncreaseextensiontimeIncreasetemplateconcentrationIncreaseoverallprimerconcentrationAdjustTaqpolymeraseconcentrationChangeKCl(buffer)concentration,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mMIncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.Addadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8μg/μLfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerolCombinesome/alloftheaboveUnspecificpro