實驗七細胞器的分級分離

實驗七細胞器的分級分離第一頁，共十七頁，2022年，8月28日實驗目的

學習分離細胞器的一般原理及方法第二頁，共十七頁，2022年，8月28日實驗原理

細胞內不同細胞器的比重和大小都不相同，在均勻密度介質中不同離心力下沉降的細胞器組成不同或在梯度介質中離心后分布于不同密度層，根據這一原理，差速離心法或密度梯度離心法就可將細胞內各種組分分離出來。分離流程：破碎組織（勻漿或研磨）－差速離心或密度梯度離心分離細胞器－結果檢驗分析第三頁，共十七頁，2022年，8月28日勻漿（Homogenization）低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣)進行破碎細胞使之成為各種細胞器及其包含物的勻漿。第四頁，共十七頁，2022年，8月28日各種勻漿、研磨器第五頁，共十七頁，2022年，8月28日差速離心分級分離(Fractionation)由低速到高速離心逐漸沉降細胞器。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉速將上清液中的小顆粒沉淀下來。

DifferentialcentrifugationHighspeedLowspeed第六頁，共十七頁，2022年，8月28日密度梯度離心（densitygradientcentrifugationmethod）亦稱平衡密度梯度離心法。用超速離心機對小分子物質溶液，長時間加一個離心力場達到沉降平衡，在沉降池內從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內比溶劑密度大的部分就產生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。第七頁，共十七頁，2022年，8月28日Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation第八頁，共十七頁，2022年，8月28日分析分級分離得到的組分，可用細胞化學和生化方法進行形態(tài)和功能鑒定。第九頁，共十七頁，2022年，8月28日（一）實驗材料

多葉綠菜第十頁，共十七頁，2022年，8月28日實驗試劑0.4M蔗糖0.35M氯化鈉（每升19.856g氯化鈉）第十一頁，共十七頁，2022年，8月28日實驗用品1、普通臺式離心機：4臺2、研缽：30個3、40ml小燒杯:30個4、紗布：5包5、離心管60支6、載玻片及蓋玻片見指導。第十二頁，共十七頁，2022年，8月28日一、葉綠體的分離第十三頁，共十七頁，2022年，8月28日細胞中及勻漿中的葉綠體第十四頁，共十七頁，2022年，8月28日葉綠體的分離步驟1、采樣、洗滌、去葉脈：最好在晴天上午10時左右選取生長正常的菠菜葉子（菜心、白菜、豌豆也可）洗干凈，用吸水紙擦干，去柄及粗脈2、預冷：放入4℃冰箱預冷1h；3、研磨勻漿：稱2克葉子在玻璃研缽中剪碎，先加1－2m1制備液，快速磨成勻漿，然后再加8m1制備液，磨勻；4、過濾：把勻漿液倒在6層沙布上過濾入小燒杯；第十五頁，共十七頁，2022年，8月28日5、離心去完整細胞、細胞核等：上述濾液轉入10ml離心管，平衡后在約500rpm（每分鐘的轉速）離心2分鐘，上清轉入另一離心管；6、離心收集葉綠體：上清液在2600rpm離心5分鐘，棄上清液，沉淀即是葉綠體。7、懸浮葉綠體：沉淀中加入制備液適量，用吸管吹打懸浮、混勻：8、鏡檢分離效果9、葉綠體被膜完整度的測定：鐵氰化鉀光還原的Hill反應第十六頁，共十七頁，2022年，8月28日葉綠