基因芯片簡介

基因芯片簡介基因芯片簡介隨著人類基因組（測序）計劃（Humangenomeproject）的逐步實施以及分子生物學相關學科的迅猛發(fā)展，越來越多的動植物、微生物基因組序列得以測定，基因序列數(shù)據(jù)正在以前所未有的速度迅速增長。然而,怎樣去研究如此眾多基因在生命過程中所擔負的功能就成了全世界生命科學工作者共同的課題。為此，建立新型雜交和測序方法以對大量的遺傳信息進行高效、快速的檢測、分析就顯得格外重要了。基因芯片（又稱DNA芯片、生物芯片）技術就是順應這一科學發(fā)展要求的產(chǎn)物，它的出現(xiàn)為解決此類問題提供了光輝的前景。該技術系指將大量（通常每平方厘米點陣密度高于400）探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。早在八十年代，BainsW.等人就將短的DNA片斷固定到支持物上，借助雜交方式進行序列測定。但基因芯片從實驗室走向工業(yè)化卻是直接得益于探針固相原位合成技術和照相平板印刷技術的有機結合以及激光共聚焦顯微技術的引入。它使得合成、固定高密度的數(shù)以萬計的探針分子切實可行，而且借助激光共聚焦顯微掃描技術使得可以對雜交信號進行實時、靈敏、準確的檢測和分析。正如電子管電路向晶體管電路和集成電路發(fā)展是所經(jīng)歷的那樣，核酸雜交技術的集成化也已經(jīng)和正在使分子生物學技術發(fā)生著一場革命?，F(xiàn)在全世界已有十多家公司專門從事基因芯片的研究和開發(fā)工作，且已有較為成型的產(chǎn)品和設備問世。主要代表為美國Affymetrix公司。該公司聚集有多位計算機、數(shù)學和分子生物學專家，其每年的研究經(jīng)費在一千萬美元以上，且已歷時六七年之久，擁有多項專例。產(chǎn)品即將或已有部分投放市場，產(chǎn)生的社會效益和經(jīng)濟效益令人瞻目?；蛐酒夹g由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量序列進行檢測和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交（SouthernBlotting和NorthernBlotting等）技術操作繁雜、自動化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等不足。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、實變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等?；蛐酒脑砘蛐酒?genechip)的原型是80年代中期提出的?；蛐酒臏y序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，可以用圖11-5-1來說明。在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列?；蛐酒址Q為DNA微陣列(DNAmicroarray)為三種主要類型：1）固定在聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標記的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術進行檢測。這種方法的優(yōu)點是所需檢測設備與目前分子生物學所用的放射顯影技術相一致,相對比較成熟。但芯片上探針密度不高，樣品和試劑的需求量大，定量檢測存在較多問題。2）用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列，通過與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。這種方法點陣密度可有較大的提高，各個探針在表面上的結合量也比較一致，但在標準化和批量化生產(chǎn)方面仍有不易克服的困難。3）在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列,與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。該方法把微電子光刻技術與DNA化學合成技術相結合，可以使基因芯片的探針密度大大提高，減少試劑的用量，實現(xiàn)標準化和批量化大規(guī)模生產(chǎn)，有著十分重要的發(fā)展?jié)摿?。它是在基因探針的基礎上研制出的，所謂基因探針只是一段人工合成的堿基序列，在探針上連接一些可檢測的物質(zhì)，根據(jù)堿基互補的原理，利用基因探針到基因混合物中識別特定基因。它將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析?；蛐酒ㄟ^應用平面微細加工技術和超分子自組裝技術，把大量分子檢測單元集成在一個微小的固體基片表面，可同時對大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測和分析。由于尚未形成主流技術，生物芯片的形式非常多，以基質(zhì)材料分，有尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠等；以所檢測的生物信號種類分，有核酸、蛋白質(zhì)、生物組織碎片甚至完整的活細胞；按工作原理分類，有雜交型、合成型、連接型、親和識別型等。由于生物芯片概念是隨著人類基因組的發(fā)展一起建立起來的，所以至今為止生物信號平行分析最成功的形式是以一種尼龍膜為基質(zhì)的“cDNA陣列”，用于檢測生物樣品中基因表達譜的改變?；蛐酒闹饕愋湍壳耙延卸喾N方法可以將寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。這些方法總體上有兩種，即原位合成（insitusynthesis）與合成點樣兩種。支持物有多種如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但需經(jīng)特殊處理。作原位合成的支持物在聚合反應前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）并與保護基建立共價連接；作點樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附帶負電荷的探針分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚賴氨酸等。原位合成法主要為光引導聚合技術（Light-directedsynthesis），它不僅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引導聚合技術是照相平板印刷技photolithography）與傳統(tǒng)的核酸、多肽固相合成技術相結合的產(chǎn)物。半導體技術中曾使用照相平板技術法在半導體硅片上制作微型電子線路。固相合成技術是當前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技術成熟且已實現(xiàn)自動化。二者的結合為合成高密度核酸探針及短肽陣列提供了一條快捷的途徑。以合成寡核苷酸探針為例，該技術主要步驟為：首先使支持物羥基化，并用光敏保護基團將其保護起來。每次選取擇適當?shù)谋喂饽ぃ╩ask）使需要聚合的部位透光，其它部們不透光。這樣，光通過蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羥基解保護。因為合成所用的單體分子一端按傳統(tǒng)固相合成方法活化，另一端受光敏保護基的保護，所以發(fā)生偶聯(lián)的部位反應后仍舊帶有光敏保護基團。因此，每次通過控制蔽光膜的圖案（透光與不透光）決定哪些區(qū)域應被活化，以及所用單體的種類和反應次序就可以實現(xiàn)在待定位點合成大量預定序列寡聚體的目的。該方法的主要優(yōu)點是可以用很少的步驟合成極其大量的探針陣列。例如，合成48（65536）個探針的8聚體寡核苷酸序列僅需4×8=32步操作，8小時就可以完成。而如果用傳統(tǒng)方法合成然后點樣，那么工作量的巨大將是不可思議的。同時，用該方法合成的探針陣列密度可高達到106/cm2。不過，盡管該方法看來比較簡單，實際上并非如此。主要原因是，合成反應每步產(chǎn)率比較低，不到95%。而通常固相合成反應每步的產(chǎn)率在99%以上。因此，探針的長度受到了限制。而且由于每步去保護不很徹底，致使雜交信號比較模糊，信噪比降低。為此有人將光引導合成技術與半異體工業(yè)所用的光敏抗蝕技術相結合，以酸作為去保護劑，使每步產(chǎn)率增加到98%。原因是光敏抗蝕劑的解離對照度的依賴是非線性的，當照度達到特定的閾值以上保護劑就會解離。所以，該方法同時也解決了由于蔽光膜透光孔間距離縮小而引起的光衍射問題，有效地提高了聚合點陣的密度。另據(jù)報導，利用波長更短的物質(zhì)波如電子射線去除保護可使點陣密度達到1010/cm2。除了光引導原位合成技術外，有的公司如美國IncytePharmaceuticals等使用壓電打印法(Piezoelectricprinting)進行原位合成。其裝置與普通的彩色噴墨打印機并無兩樣，所用技術也是常規(guī)的固相合成方法。做法是將墨盒中的墨汁分別用四種堿基合成試劑所替代，支持物經(jīng)過包被后，通過計算機控制噴墨打印機將特定種類的試劑噴灑到預定的區(qū)域上。沖洗、去保護、偶聯(lián)等則同于一般的固相原位合成技術。如此類推，可以合成出長度為40到50個堿基的探針，每步產(chǎn)率也較前述方法為高，可達到99%以上。盡管如此，通常原位合成方法仍然比較復雜，除了在基因芯片研究方面享有盛譽的Affymetrix等公司使用該技術合成探針外，其它中小型公司大多使用合成點樣法。后一方法在多聚物的設計方面與前者相似，合成工作用傳統(tǒng)的DNA或多肽固相合成儀以完成，只是合成后用特殊的自動化微量點樣裝置將其以比較高的密度涂布于硝酸纖維膜、尼龍膜或玻片上。支持物應事先進行特定處理，例如包被以帶正電荷的多聚賴酸或氨基硅烷?，F(xiàn)在已有比較成型的點樣裝置出售，如美國Biodot公司的點膜產(chǎn)品以及CartesianTechnologies公司的PixSysNQ/PA系列產(chǎn)品。前者產(chǎn)生的點陣密度可以達到400/cm2，后者則可達到2500/cm2?；蛐酒南嚓P技術樣品的準備及雜交檢測目前，由于靈敏度所限，多數(shù)方法需要在標記和分析前對樣品進行適當程序的擴增，不過也有不少人試圖繞過這一問題，如MosaicTechnologies公司引入的固相PCR方法，引物特異性強，無交叉污染并且省去了液相處理的煩瑣；LynxTherapeutics公司引入的大規(guī)模并行固相克隆法(Massivelyparallelsolid-phasecloning)，可在一個樣品中同時對數(shù)以萬計的DNA片段進行克隆，且無需單獨處理和分離每個克隆。顯色和分析測定方法主要為熒光法，其重復性較好，不足的是靈敏度仍較低。目前正在發(fā)展的方法有質(zhì)譜法、化學發(fā)光法、光導纖維法等。以熒光法為例，當前主要的檢測手段是激光共聚焦顯微掃描技術，以便于對高密度探針陣列每個位點的熒光強度進行定量分析。因為探針與樣品完全正常配對時所產(chǎn)生的熒光信號強度是具有單個或兩個錯配堿基探針的5-35倍，所以對熒光信號強度精確測定是實現(xiàn)檢測特異性的基礎[8]。但熒光法存在的問題是，只要標記的樣品結合到探針陣列上后就會發(fā)出陽性信號，這種結合是否為正常配對，或正常配對與錯配兼而有之，該方法本身并不能提供足夠的信息進行分辨。對于以核酸雜交為原理的檢測技術，熒光檢測法的主要過程為：首先用熒光素標記擴增（也可以有其它放大技術）過的靶序列或樣品，然后與芯片上的大量探針進行雜交，將未雜交的分子洗去（如果用實時熒光檢測可省去此步[9]）這時，用落射熒光顯微鏡或其它熒光顯微裝置對片基進行掃描，采集每點熒光強度并對其進行分析比較。前已述及，由于正常的Watson-Crick配對雙鏈要比具有錯配堿基的雙鏈分子具有較高的熱力學穩(wěn)定性。所以，如果探針與樣品分子在不位點配對有差異則該位點熒光強度就會有所不同，而且熒光信號的強度還與樣品中靶分子的含量呈一定的線性關系。當然，由于檢測原理及目的不同，樣品及數(shù)據(jù)的處理也自然有所不同，甚至由于每種方法的優(yōu)缺點各異以至于分析結果不盡一致?；静襟E生物芯片是將生命科學研究中所涉及的不連續(xù)的分析過程(如樣品制備、化學反應和分析檢測)微機械、化學、物理技術、計算機技術在固體芯片表面構建的微流體分析單元和系統(tǒng)，使之連續(xù)化、集成化、微型化。生物芯片技術主要包括四個基本要點：芯片方陣的構建、樣品的制備、生物分子反應和信號的檢測。1、芯片制備，先將玻璃片或硅片進行表面處理，然后使DNA片段或蛋白質(zhì)分子按順序排列在片芯上。2、樣品制備，生物樣品往往是非常復雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應。可將樣品進行生物處理，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，并且加以標記，以提高檢測的靈敏度。3、生物分子反應，芯片上的生物分子之間的反應是芯片檢測的關鍵一步。通過選擇合適的反應條件使生物分子間反應處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配比率。4、芯片信號檢測，常用的芯片信號檢測方法是將芯片置入芯片掃描儀中，通過掃描以獲得有關生物信息。1、芯片制備目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。芯片的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機器人技術。以便能快速、準確地將探針放置到芯片上的指定位置。2、樣品制備生物樣品往往是復雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應，有時樣品的量很小。所以，必須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNARNA，然后用熒光標記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。3、雜交反應雜交反應是熒光標記的樣品與芯片上的探針進行的反應產(chǎn)生一系列信息的過程。選擇合適的反應條件能使生物分子間反應處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配率。4、信號檢測和結果分析雜交反應后的芯片上各個反應點的熒光位置、熒光強弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關生物信息?；蛐酒夹g發(fā)展的最終目標是將從樣品制備、雜交反應到信號檢測的整個分析過程集成化以獲得微型全分析系統(tǒng)（micrototalanalyticalsystem）或稱縮微芯片實驗室（laboratoryonachip）。使用縮微芯片實驗室，就可以在一個封閉的系統(tǒng)內(nèi)以很短的時間完成從原始樣品到獲取所需分析結果的全套操作。基因芯片的應用1998年底美國科學促進會將基因芯片技術列為1998年度自然科學領域十大進展之一，足見其在科學史上的意義。現(xiàn)在，基因芯片這一時代的寵兒已被應用到生物科學眾多的領域之中。它以其可同時、快速、準確地分析數(shù)以千計基因組信息的本領而顯示出了巨大的威力。這些應用主要包括基因表達檢測、突變檢測、基因組多態(tài)性分析和基因文庫作圖以及雜交測序等方面。在基因表達檢測的研究上人們已比較成功地對多種生物包括擬南芥（Arabidopsisthaliana母(Saccharomycescerevisiae)及人的基因組表達情況進行了研究，并且用該技術（共157,112個探針分子）一次性檢測了酵母幾種不同株間數(shù)千個基因表達譜的差異。實踐證明基因芯片技術也可用于核酸突變的檢測及基因組多態(tài)性的分析，例如對人BRCAⅠ基因外顯子11、CFTR基因、β-地中海貧血、酵母突變菌株間、HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因（與Sanger測序結果一致性達到98%）等的突變檢測，對人類基因組單核苷酸多態(tài)性的鑒定、作圖和分型，人線粒體16.6kb基因組多態(tài)性的研究[24]等。將生物傳感器與芯片技術相結合，通過改變探針陣列區(qū)域的電場強度已經(jīng)證明可以檢測到基因（ras等）的單堿基突變。此外，有人還曾通過確定重疊克隆的次序從而對酵母基因組進行作圖。雜交測序是基因芯片技術的另一重要應用。該測序技術理論上不失為一種高效可行的測序方法，但需通過大量重疊序列探針與目的分子的雜交方可推導出目的核酸分子的序列，所以需要制作大量的探針。基因芯片技術可以比較容易地合成并固定大量核酸分子，所以它的問世無疑為雜交測序提供了實施的可能性，這已為實踐所證實。在實際應用方面，生物芯片技術可廣泛應用于疾病診斷和治療、藥物篩選、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測、國防、航天等許多領域。它將為人類認識生命的起源、遺傳、發(fā)育與進化、為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設計和藥物開發(fā)中先導化合物的快速篩選和藥物基因組學研究提供技術支撐平臺。1、藥物篩選和新藥開發(fā)由于所有藥物（或獸藥）都是直接或間接地通過修飾、改變?nèi)祟悾ɑ蛳嚓P動物）基因的表達及表達產(chǎn)物的功能而生效，而芯片技術具有高通量、大規(guī)模、平行性地分析基因表達或蛋白質(zhì)狀況（蛋白質(zhì)芯片）的能力，在藥物篩選方面具有巨大的優(yōu)勢。用芯片作大規(guī)模的篩選研究可以省略大量的動物試驗甚至臨床，縮短藥物篩選所用時間，提高效率，降低風險。隨著人類基因圖譜的繪就，基因工程藥物將進入一個大發(fā)展時期，在基因工程藥物的研制和生產(chǎn)中，生物芯片也有著較大的市場。以基因工程胰島素為例，當我們把人的胰島素基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌細胞后，我們就需要用某種方法對工程菌的基因型進行分析，以便確證胰島素基因是否轉(zhuǎn)移成功。過去人們采取的方法叫做“限制性片段長度多態(tài)性”（簡稱RELP），這種方法非常地煩瑣復雜，在成本和效率方面都不如基因芯片，今后被芯片技術取代是必然的趨勢。通過使用基因芯片篩選藥物具有的巨大優(yōu)勢決定它將成為本世紀藥物研究的趨勢。2、疾病診斷基因芯片作為一種先進的、大規(guī)模、高通量檢測技術，應用于疾病的診斷，其優(yōu)點有以下幾個方面：一是高度的靈敏性和準確性；二是快速簡便；三是可同時檢測多種疾病。如應用于產(chǎn)前遺傳性疾病檢查，抽取少許羊水就可以檢測出胎兒是否患有遺傳性疾病，同時鑒別的疾病可以達到數(shù)十種甚至數(shù)百種，這是其他方法所無法替代的，非常有助于“優(yōu)生優(yōu)育這一國策的實施。又如對病原微生物感染診斷，目前的實驗室診斷技術所需的時間比較長，檢查也不全面，醫(yī)生往往只能根據(jù)臨床經(jīng)驗做出診斷，降低了診斷的準確率，如果在檢查中應用基因芯片技術，醫(yī)生在短時間內(nèi)就能知道病人是哪種病原微生物感染；而且能測定病原體是否產(chǎn)生耐藥性、對哪種抗生素產(chǎn)生耐藥性、對哪種抗生素敏感等等，這樣醫(yī)生就能有的放矢地制定科學的治療方案；再如對具有高血壓、糖尿病等疾病家族史的高危人群普查、接觸毒化物質(zhì)人群惡性腫瘤普查等等，如采用了基因芯片技術，立即就能得到可靠的結果，其他對心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、免疫性疾病、代謝性疾病等，如采用了基因芯片技術，其早期診斷率將大大提高，而誤診率會大大降低，同時有利于醫(yī)生綜合地了解各個系統(tǒng)的疾病狀況。3、環(huán)境保護在環(huán)境保護上，基因芯片也廣泛的用途，一方面可以快速檢測污染微生物或有機化合物對環(huán)境、人體、動植物的污染和危害，同時也能夠通過大規(guī)模的篩選尋找保護基因，制備防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產(chǎn)品。4、司法基因芯片還可用于司法，現(xiàn)階段可以通過DNA指紋對比來鑒定罪犯，未來可以建立全國甚至全世界的DNA指紋庫，到那時以直接在犯罪現(xiàn)場對可能是疑犯留下來的頭發(fā)、唾液、血液、精液等進行分析，并立刻與DNA罪犯指紋庫系統(tǒng)存儲的DNA“指紋進行比較，以盡快、準確的破案。目前，科學家正著手于將生物芯片技術應用于親子鑒定中，應用生物芯片后，鑒定精度將大幅提高。5、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)基因芯片技術可以用來篩選農(nóng)作物的基因突變，并尋找高產(chǎn)量、抗病蟲、抗干旱、抗冷凍的相關基因，也可以用于基因掃描及基因文庫作圖、商品檢驗檢疫等領域。目前該類市場尚待開發(fā)。6、研究領域包括基因表達檢測、尋找新基因、雜交測序、基因突變和多態(tài)性分析以及基因文庫作圖以及等方面。1、基因表達檢測。人類基因組編碼大約10萬個不同的基因，僅掌握基因序列信息資料，要理解其基因功能是遠遠不夠的，因此，具有監(jiān)測大量mRNA（信使RNA，可簡單理解為基因表達的中介物）的實驗工具很重要。有關對芯片技術檢測基因表達及其敏感性、特異性進行的研究實驗表明芯片技術易于監(jiān)測非常大量的mRNAs并能敏感地反映基因表達中的微小變化。利用基因芯片技術人們已比較成功地對多種生物包括擬南芥、酵母及人的基因組表達情況進行了研究，并且用該技術（共157,112個探針分子）一次性檢測了酵母幾種不同株間數(shù)千個基因表達譜的差異。2、尋找新基因。有關實驗表明在缺乏任何序列信息的條件下，基因芯片也可用于基因發(fā)現(xiàn)，如HME基因和黑色素瘤生長刺激因子就是通過基因芯片技術發(fā)現(xiàn)的。3、DNA測序。人類基因組計劃的實施促進了更高效率的、能夠自動化操作的測序方法的發(fā)展，芯片技術中雜交測序技術及鄰堆雜交技術即是一種新的高效快速測序方法。如使用美國Affymetrix公司1998年生產(chǎn)出的帶有13.5萬個基因探針的芯片就可以使人類DNA解碼速度提高了25倍。4、核酸突變的檢測及基因組多態(tài)性的分析。有關實驗結果已經(jīng)表明DNA芯片技術可快速、準確地研究大量患者樣品中特定基因所有可能的雜合變異。對人類基因組單核苷酸多態(tài)性的鑒定、作圖和分型，人線粒體16.6kb基因組多態(tài)性的研究等。隨著遺傳病與癌癥相關基因發(fā)現(xiàn)數(shù)量的增加，變異與多態(tài)性分析必將越來越重要。基因芯片技術的研究方向及當前面臨的困難盡管基因芯片技術已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，得到世人的矚目，但仍然存在著許多難以解決的問題，例如技術成本昂貴、復雜、檢測靈敏度較低、重復性差、分析泛圍較狹窄等問題。這些問題主要表現(xiàn)在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等幾個方面。樣品制備上，當前多數(shù)公司在標記和測定前都要對樣品進行一定程度的擴增以便提高檢測的靈敏度，但仍有不少人在嘗試繞過該問題，這包括MosaicTechnologies公司的固相PCR擴增體系以及LynxTherapeutics公司提出的大量并行固相克隆方法，兩種方法各有優(yōu)缺點，但目前尚未取得實際應用。探針的合成與固定比較復雜，特別是對于制作高密度的探針陣列。使用光導聚合技術每步產(chǎn)率不高（95%難于保證好的聚合效果。應運而生的其它很多方法，如壓電打壓、微量噴涂等多項技術，雖然技術難度較低方法也比較靈活，但存在的問題是難以形成高密度的探針陣列，所以只能在較小規(guī)模上使用。最近我國學者已成功地將分子印章技術應用于探針的原位合成而且取得了比較滿意的結果（個人通訊）。目標分子的標記也是一個重要的限速步驟，如何簡化或繞過這一步現(xiàn)在仍然是個問題。目標分子與探針的雜交會出現(xiàn)一些問題：首先，由于雜交位于固相表面，所以有一定程度的空間阻礙作用，有必要設法減小這種不利因素的影響。Southern曾通過向探針中引入間隔分子而使雜交效率提高于了150倍。其次，探針分子的GC含量、長度以及濃度等都會對雜交產(chǎn)生一定的影響，因此需要分別進行分析和研究。信號的獲取與分析上，當前多數(shù)方法使用熒光法進行檢測和分析，重復性較好，但靈敏仍然不高。正在發(fā)展的方法有多種，如質(zhì)譜法、化學發(fā)光法等?；蛐酒铣汕先f的寡核苷酸探針由于序列本身有一定程度的重疊因而產(chǎn)生了大量的豐余信息。這一方面可以為樣品的檢測提供大量的驗證機會，但同時，要對如此大量的信息進行解讀，目前仍是一個艱巨的技術問題。我國基因芯片的研究現(xiàn)狀目前，我國尚未有較成型的基因芯片問世，但據(jù)悉已有幾家單位組織人力物力從事該技術的研制工作，并且取得了一些可喜的進展。這是一件好事，標志著我國相關學科與技術正在走向成熟?；蛐酒夹g是一個巨大的產(chǎn)業(yè)方向，我們國家的生命科學、計算機科學乃至精密機械科學的工作者們應該也可以在該領域內(nèi)占有一席之地。但是我們應該充分地認識到，這不是一件輕易的事，不能夠蜂擁而至，不能“有條件沒有條件都要上，去從事低水平重復性的研究工作，最終造成大量人力物力的浪費。而應該是有組織、有計劃地集中具有一定研究實力的單位和個人進行攻關，這也許更適合于我國國情。基因芯片在臨床疾病診斷的應用GenechipDNADNACHIPDNADNAarraysoligonucleotidemicro-chip是90Affymetrix公司的Fodor術在醫(yī)學各個領域中的應用均已取得巨大突破。1998年底，美國科學促進會將基因芯片列為1998年度自然科學領域十大進展之一。1基在芯片制備技術首先要解決的技術是如何在芯片片基上定位合成高密度的核酸探針。目前，基因芯片的制備技術主要有以下幾種：1.1原位合成是指直接在芯片上用四種核苷酸合成所需探針的基因芯片制備技術，主要包括：1.1.1原位光刻成是由美國Affymetrix公司發(fā)展的結合了半導體工業(yè)的光刻技術和DNA合成技術制造高密度核酸陣合成循環(huán)中呈指數(shù)增長，例如一個完整的十核苷酸序列通過32個合成步驟，8個小時即可成65536（216）條探針。1.1.2原位噴印合成芯片原位噴印合成原理與噴墨打印液體而不是碳粉；采用的化學原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制備的化學試劑。1.1.3分子印章多次壓印合成根據(jù)所需微陣列，設計有256×256104-106種）生物分子探MEMS擴增，以及雜交后的信息檢測相集成，制備成縮微芯片。1.2合成點樣cDNA或基因組DNA通自動化技術的進步，合成點樣技術又重現(xiàn)生機。目前，除Affymetrix等研究和生產(chǎn)基因芯片的少數(shù)大人司使用原位合成外，其他中小型公司和實驗室研究中仍然普遍采用合成點樣法。1.2.1微型機械點樣法該技術是由Shalon和Brown于1995年發(fā)展起來的一類芯片制備技術，而后由美國Synteni公動化生產(chǎn)。1.2.2化學噴射法此方法先進之處在于采用了墳電和其也推動方式從微型噴嘴向固體表面轉(zhuǎn)移生化成分（cDNA、DNA、抗體、小分子等該技術由IncytePharmaceuticals和Protogene制。1980年Bains等將預先合成的短DNA片段固定在固相支持在芯片制作的最原始的方法。由Affymetrix公司發(fā)展起來的光導ODTA合成照相平板印刷術將基因芯片引入了工業(yè)化生產(chǎn)的階“縮微實驗室”功：電子芯片、三維芯片、流過式芯片、石英諧振芯片。2基因芯片在臨床疾病診斷中的應用2.1核酸序列分析核酸序列分析是基因芯片發(fā)展和應用的DNAsequencingbyhybridization,SBH）contiguousstackinghybridization，CSH2.1.1雜交測序技術采用SBH技術，用含65536個8聚寡核苷酸的微陣列，可測定200bp長DNA序列，采用67108864個13DNA測序。Chen等用含135000個寡核苷酸探針的陣列測定了全長為16.6kb的人線粒體基因組序列，準確率達99%。Hacia等用含有48000個寡核苷酸的高密度微陣列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差異，結果發(fā)現(xiàn)在外顯子11約3.4kb長度范圍內(nèi)的核酸序列同源性在98.2%到83.5%2.1.2鄰堆雜交技術SBH技術的效率隨著微陣列中寡核CSH技術彌補了SBHCSH技術的應用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長度，加強了序列準確性，可進行校長的DNA測序。2.1.3毛細管電泳芯片測序技術Mathies等成功地應用通過光刻加工出的毛細管電泳測定芯片在10min內(nèi)完成了含433堿基對的DNACuraGen公司和普林斯頓大學也正在從事這類芯片的研究開發(fā)工作。2.2基因表達分析隨著人類基因組計劃的順利進行，基因成千上萬個基因的表達情況。對大多數(shù)基因而言，mRNA表達水平與其蛋白質(zhì)的表達水平相對應，基因芯片技術可直接測到mRNAr的種類及豐度，可快速地以1300000水平出現(xiàn)的mRNA。表達譜基因芯片研究基因表達與傳統(tǒng)的NorthernBlot相比有許費用和時間。2.3尋找新基因定量檢測大量基因表達水平在闡述基因功表達方面是一項十分有用的技術，它具有樣品用量極少，自動化程度高等優(yōu)點，便于大量篩選新基因。目前，大量人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫中400000個ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達分析。2.4突變體和多態(tài)性檢測檢測基因突變對于闡明腫瘤與遺和多態(tài)性時多采用PCR-SSCPDNA聚合酶或連接酶結合檢測時可獲得更高的分Hacia等用含96000個寡核苷酸探針的基因芯片來檢測遺傳性乳腺癌基因兒卵巢癌基因BRCA1第11外顯子3.45kb長度內(nèi)的所有可能的發(fā)合性突變，包括堿基替換及小的插入、缺失乖，99%CGAPLipshutz等證明基因芯片可用來篩選HIV病毒的蛋白酶基因和反轉(zhuǎn)錄酶基因的突變。這些突變能引起對抗生素，如AZT等的抗性。Affymetrix公司已制造出商用HIV1040個蛋白酶和Chee等制造了含有135000個25-mer探針的基因芯片來探測16.6kb的人線粒體基因組，共分析了10個樣本，檢出505個多態(tài)。每個樣本可在12min99%傳病表型與DNA（SingleNucleotideePolymorphisms,SNPs）為標記可幫助區(qū)分兩個個體遺傳物質(zhì)的差異，若能將所有SNPs全部信息裝入生物芯片則可檢測到與之相關的基因間差異。2.5后基因組研究Davis研究小組的研究提示DNA芯片技術將來可能應用于人類基因組測序完成后闡明開放讀碼框架ORFDavis研究小組利用DNA芯片技術對酵母缺失突變株進行定量分析以確定酵母全序列測定完成后新發(fā)現(xiàn)的ORF產(chǎn)生多個ORF缺失的酵母突變株，并在缺失ORF旁引入20個核苷酸的標志序列作為缺失ORF的身份標志，謂之“分子條形碼”（molecularbarcodes）,分子條形碼可與基因芯片上的探針進ORF的功能測試可通過一次雜交及用同一生長選擇條件完成，大大提高了效率和準確性。2.6疾病的診斷從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標準圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA現(xiàn)代化診斷新技術。例如,Affymetrix公司和Oncormed公司合作研制的可監(jiān)測50%以上腫瘤患者p53基因突變的p53基因芯片斷，待測樣品用量?。荒芴禺愋詸z測病原微生物的亞型及變異；“醫(yī)學）“DNARNA段醫(yī)學）間內(nèi)找到正確的治療措施。2.6.1遺傳病相關基因的定位隨著人類基因組計劃的完精神病等?；蚨ㄎ惶N含著巨大的商業(yè)價值。通過制作基因定體上的合適位點定位出遺傳病相關基因。近幾年，諸如Affymetrix等公司已研制出可檢測大量遺傳病基因相關點突變及SNP有望創(chuàng)造更精確的第三代遺傳圖譜。2.6.2感染性疾病的診斷HIV-1基因中的rt與pro在疾生物基因。Heller等等采用基因表達譜芯片研究了類風濕關節(jié)診斷芯片、結核桿菌耐藥性檢測芯片、多種惡性腫瘤相關病毒芯片中最具有商業(yè)價值的應用。27基因文庫圖譜繪制繪制，每人每天可對幾百個克隆進行基因圖譜繪制。其它應用巨大的社會效益和經(jīng)濟利益?；蛐酒瑢嶒灢僮髁鞒虉D基因芯片實驗操作流程包括樣本DNA或RNA交及洗滌等步驟1．樣本DNA或RNA制備學實驗手冊就可以。但對于RNA樣本，由于RNA的穩(wěn)定性很差，驗成功率或結果的可靠性。2．核酸標記方式分子生物學常用的標記方法有同位素標記和非同位素標記33P32P125I及3H等化學發(fā)光標記和德克薩斯紅(Texasred)、熒光系、羅丹明、Cy3、Cy5等。生物位素標記方法?；蚩贵w—(nicktranslation)PCR轉(zhuǎn)錄等。在酶反應過程中摻人帶熒光的dNTP，從而標記新合成PCR轉(zhuǎn)錄法，也可以將熒光基團通過化學反應加到引物的末端。3．樣品標記方法樣本標記方法很多，這里僅舉幾種常用的方法。(1)RNARNA不同剪切體的研究，是針對RNA樣本進行標記。最常見的標記方式是用Cy3或Cy5不同的樣本。如Cy3或Cy5標記的dNTP，通過酶反應摻人到待RNA樣本量20fig的總RNA夠的RNA，這時可以采用RNA線性擴增方法，最普遍采用的RNA擴增方法是RNA體外線性擴增方法。(2)DNACGH分析、SNP、分子分型或甲基化研究時，主要選用DNACGH要的DNA2pg以上的基因組DNA全基因組DNASNPCGHSNP檢測的是DNA的“質(zhì)，而不像表達譜或CGH質(zhì)檢測核酸的“量，因此不必要考慮標記時DNA的線性關系，可以采用其他SNPPCR標記方法標記目的片段代SNP的檢測原理，另一種類似CGH的方法。Affymetrix基因芯片前景Affymetrix基因芯片技術是用于基因組學和轉(zhuǎn)錄組學研究的整合平臺，該技術平臺既可以分析基因組DNARNADNA水平上既可以做SNPDNA再測序。Affymetrix基因芯片技術是基因芯片領域的國際行業(yè)標準,已經(jīng)為國際生命科學和醫(yī)學、植物及微生物等基礎研究領域廣泛認可,利用Affymetrix基因芯片技術作為主要研究手段之一在國際科學雜志發(fā)表的論文達7336篇(今年1-9月已經(jīng)有2103篇),僅在Nature,Science,新英格蘭醫(yī)學雜志和Cell影響因子非常高的雜志發(fā)表的論文就數(shù)百篇.Affymetrix基因芯片技術也正在走向?qū)嶋H應用.2004年,Affymetrix的儀器和芯片制造設備通過ISO認證,其GeneChip(R)System3000Dx(GCS3000Dx)通過美國FDA和歐盟CE認證,成為第一個可以分析體外診斷芯片的基因芯片系統(tǒng),成為核酸診斷(基因型分析和基因表達分析)的標準平臺.Affymetrix基因芯片系統(tǒng)截止06年03月底在全世界的裝機量超過1420套(其中超過80套GCS3000Dx售給Affymetrix的診斷開發(fā)合作伙伴及檢驗科),在整個基因芯片領域是首屈一指和獨占鰲頭的.國際上著名的大學,研究機構和跨國制藥公司幾乎全部具有Affymetrix基因芯片技術平臺.就在發(fā)明基因芯片點樣技術的斯坦福大學就有10套系統(tǒng)。目前可以提供生命科學研究和醫(yī)學研究的模式生物的全基因組表達譜芯片,狗、雞、果蠅、大腸桿菌、人、小鼠、綠膿桿菌、按蚊/瘧原蟲、豬、恒河猴、大鼠、金黃mRNA表達,同時可以檢測禽類17種病毒的684個基因的表達。而恒河猴表達譜芯片可以檢測恒河猴和靈長類病毒的基因表達。利用表達譜芯片，通過對已經(jīng)鑒定的基因及其剪接體表達水平的檢測，已經(jīng)發(fā)表了諸多論文,并且還有用表達普芯片找到疾病易感基因的報道(Science.308(5720):385-9,2005Apr15.Epub2005Mar10)100KSNP芯片技術掃描96個病人和50個正常人，直接找到了黃斑變性的易感基因為CFH。而03-04年有5篇國際論5篇論文都用STR明1號染色體的某個區(qū)域與該疾病有關。SNP芯片找到的黃斑變性易感基因CFH就在該染色體區(qū)域內(nèi)！頂級醫(yī)學雜志"新英格蘭醫(yī)學雜志"今年六月這期又發(fā)表了利用AFFYMETRIX表達譜技術的兩篇論文:利用基因表達譜芯片技術改進了伯杰氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)診斷的精確!!!被病理專家分類為Burkitt'slymphoma的病人的基因表達特點完全可以把Burkitt'slymphoma及彌散性大B細胞淋巴瘤(diffuselarge-B-celllymphoma)區(qū)分開!兩個研究分別做了220和303例病人的基因表達Affymetrix基因芯片技術被廣泛應用于人類和動物生命科學的基礎研究中,如鑒定發(fā)育、生長、分裂、分化、細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導等重要生命過程的相關基因,鑒定疾病相關基因,如大量的研究在利用基因芯片技術鑒定癌癥發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的基因,對癌癥進行分子分類/分期，尋找癌癥分子機制的關鍵分子,為癌癥診斷篩選重要標志分子,為癌癥治療篩選重要的靶分子,預后分析等.Affymetrix的SNP芯片可以用于在全基因組水平上尋找人類疾病或其他性狀的相關基因即用于醫(yī)學遺傳學的連鎖分析(linkage,10/50K)和關聯(lián)分析(association,100/250/500K/1000K).由于SNP是比STR密度很高的分子標記,因此與STR技術做連鎖分析(linkage)/性狀相關基因相比較,100/250/500K/1000KSNP芯片技術做關聯(lián)分析(association)可以精確地將特定基因與疾病/性狀直接關聯(lián)起來,而STR全基因組掃描連鎖分析只能先找到與疾病/性狀相關的染色體區(qū)域(長達5-10Mbp或更長、含數(shù)十到數(shù)百個基),進一步還得利用該區(qū)域更密的分子標記(如加密STR或SNPs)/性狀的基因.SNP芯片推出四年來,已經(jīng)發(fā)表了很多研究文獻(,這些文獻涉及疾病/性狀相關基因?qū)ふ?即linkageanalysis和GENOMEWIDEASSOCIATION),群體遺傳學(populationgenetics),染色體拷貝數(shù)變化分析(chromosomalcopynumberchangesduringcancerprogression,即染色體缺失,擴增和LOH).目前,在全球范圍內(nèi)已經(jīng)有數(shù)百個大學,研究機構和制藥公司在利用SNP芯片技術進行相關研究.Affymetrix可以提供3種規(guī)格人的SNP芯片,分別是:10K,50/100K和250/500K/1000K,一次性分析人的1萬個、10萬個、50萬、100萬個SNP基因定位的報道就有幾十篇，還有許多其它研究的報道SuperArray基因芯片實驗操作步驟SuperArray基因芯片實驗操作步驟:RNA抽提RNA質(zhì)量檢測探針合成芯片雜交化學發(fā)光檢測圖象采集和數(shù)據(jù)分析RNA抽提TRIZOL試劑(Invitrogenlifetechnologies)氯仿異丙醇75%乙醇(以DEPC處理的水配制)無RNA酶的水無RNA酶的糖原(Invitrogenlifetechnologies)1.勻漿a.組織勻漿每50-100mg組織樣品,加入1ml的TRIZOL試劑,用電動勻漿器進行勻漿.所加樣品體積不能超過勻漿此樣品所使用的TRIZOL試劑體積的10%.b.單層貼壁細胞勻漿直接在3.5cm直徑的培養(yǎng)盤中加入1mlTRIZOL試劑裂解細胞裂解時用槍吸打幾次.加入TRIZOL試劑的量取決于培養(yǎng)盤的面積(每10cm2加1ml)而不是培養(yǎng)細胞的數(shù)量.c.懸浮細胞的勻漿離心沉淀細胞.加入TRIZOL試劑反復吹打使細胞裂解.每5-10×106的動物植物或酵母細胞或者每1×107的細菌使用1mlTRIZOL試劑,避免在加入TRIZOL試劑進行裂解前清洗細胞,因為清洗會很可能導致mRNA的降解.對于某些酵母和細菌的細胞,需要使用勻漿器來破碎細胞.2.兩相分離勻漿后樣品于15到30°C孵育5分鐘,以便核酸蛋白復合體完全解離.每1ml的TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿蓋緊管蓋.手動劇烈振蕩管體15秒后,15到30°C孵育2到3分鐘.4°C下12,000×g離心15分鐘.離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相,中間層核上層的無色的水相.RNA全部被分配于水相中.水相的體積大約使勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%.3.RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中.水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA,加入異丙醇的量為每個樣品勻漿時加入1mlTRIZOL試劑的此時加0.5ml的異丙醇.混勻后15到30°C孵育10分鐘后,于4°C12,000×g離心10分鐘.此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊.4.RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1ml的75%乙醇,清洗RNA沉淀.振蕩后,4°C7,500×g離心5分鐘.5.重新溶解RNA沉淀去除乙醇溶液,空氣中干燥RNA沉淀5-10分鐘,切勿真空離心干燥.注意RNA沉淀不要完全干燥,否則將大大降低RNA的可溶性.部分溶解的RNA樣品A260/280比值將小于1.6.溶解RNA時,先加入無RNA酶的水用槍反復吹打幾次,然后55到60°C孵育10分鐘.獲得的RNA溶液保存于-70°C.小量RNA的抽提:從少量的組織(1到10mg)或者細胞(102到104)樣品中抽提RNA:加入800l的TRIZOL試劑至樣品中,樣品裂解后,按步驟2加氯仿進行兩相分離.在加異丙醇沉淀RNA前,加5-10ug的無RNA酶的糖原作為水相載體.為降低溶液粘度,在加氯仿前先將樣品兩次過26號針頭以剪切基因組DNA.兩相分離后糖原留在水相中并和RNA共沉淀.只要糖原濃度不高于4mg/ml,不會影響cDNA的合成,同樣也不會對PCR過程產(chǎn)生影響.RNA質(zhì)量檢測TE:10mMTris-HClpH8,1mMEDTA0.4MMOPS,pH7.00.1M乙酸鈉0.01MEDTA甲醛甲醛上樣染液(ambion,)溴化乙錠(EthidiumBromide,EB)瓊脂糖1.紫外吸收測定法取少量液體用TE(一般1:100)后,讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,可以測定RNA溶液濃度和純度.用來稀釋的TE不需要經(jīng)過無RNA酶處理,因為RNA的微量降解不會明顯影響分光光度計的讀值.測量前需先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零.a.濃度測定A260下讀值為1表示40gRNA/ml.樣品RNA(g/ml)計算公式為:A260X稀釋倍數(shù)X40g/ml.具體計算如下:RNA溶于40lDEPC水中,取5ul,1:100稀釋至495l的TE中,測得A260=0.21RNA濃度=0.21X100X40g/ml=840g/mlor0.84g/l取5ul用來測量以后,剩余樣品RNA為35l,剩余RNA:35lX0.84g/l=29.4gb.純度檢測RNA溶液的A260/A280的比值是一種RNA純度檢測方法,比值范圍1.8到2.1.即使比值超出這個范圍,RNA樣品也一樣可以用于一些普通實驗中如Northern雜交,RT-PCR和RNA酶保護實驗.樣品OD260OD280OD260/OD280RNA濃度(ug/ul)A1.0760.5421.998.61B1.0500.5831.808.402.變性瓊脂糖凝膠電泳a.制膠1g瓊脂糖溶于72ml水中,冷卻至60°C,10ml的10XMOPS電泳緩沖液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M).10XMOPS電泳緩沖液:濃度成分0.4MMOPS,pH7.00.1M乙酸鈉0.01MEDTA灌制凝膠板,預留加樣孔至少可以加入25l溶液.膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽內(nèi),加足量的1XMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米.b.準備RNA樣品取3gRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10g/ml.加熱至70°C孵育15分鐘使樣品變性.c.電泳上樣于膠孔中,5–6V/cm電壓下電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm.d.紫外透射光下觀察并拍照28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍.還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成.在18S和28S核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì),可能是由mRNA和其它異型RNA組成.RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染,將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn),即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶.RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散.探針合成方法一:用于化學發(fā)光檢測的RT標記法無RNA酶的H2O10×RT緩沖液(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-04)RNA酶抑制劑,RNaseInhibitor(Promega,CatNo.N2511)MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶,MMLVReverseTranscriptase(PromegaCat.No.M1701)緩沖液A(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-04)生物素標記dUTP,Biotin-16-dUTP(RocheCat.No.1-093-070)DTTdNTP混合液(dATP,dCTP,dGTP和0.5mMdTTP各5mM)a.配制緩沖液BN取50μL的10XRT緩沖液,1μL的1MDTT和50μL的dNTP混合液,混勻,保存于–20°C.b.配制退火混合液:每個總RNA樣品如下配制于一個滅菌PCR管中:總RNA5.0μg緩沖液A3μl無RNA酶的H2O加至總體積為10μl上述溶液用槍輕輕吸打混合均勻,離心至管低.混合液放于70°C水浴鍋中孵育3分鐘,立刻放在42°C水浴中孵育2分鐘.c.配制RT混合液:當退火混合液70°C孵育時即可配制RT混合液.RT混合液1張芯片2張芯片4張芯片緩沖液BN4μl8μl16μlBiotin-16-dUTP2μl4μl8μl無RNA酶的H2O2μl4μl8μlRNaseInhibitor1μl2μl4μlMMLVReverseTranscriptase1μl2μl4μl總體積10μl20μl40μlRT混合液42°C孵育1分鐘,然后進行下一步驟.d.RT反應:每張芯片探針制備:加10μl預熱的RT混合液到10μl退火混合液中,用槍輕輕吸打混勻,繼續(xù)在42°C孵育90分鐘.e.探針變性:反應得到的cDNA探針于94°C加熱5分鐘,然后迅速放入冰中.此cDNA探針即可用于雜交.方法二:用于化學發(fā)檢測的AMPOLABELING-LPR標記法RT引物(P)(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-03)無RNA酶的H2O(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-03)10×RT緩沖液(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-04)緩沖液AF(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-03)LPR緩沖液(L)(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-03)DNA聚合酶(LE)(SuperArrayBioscience,CatalogNumberL-03)RNA酶抑制劑,RNaseInhibitor(Promega,CatNo.N2511)MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶,MMLVReverseTranscriptase(PromegaCat.No.M1701)生物素標記dUTP,Biotin-16-dUTP(RocheCat.No.1-093-070)DTTdNTP混合液(dATP,dCTP,dGTP和0.5mMdTTP各5mM)a.配制緩沖液BN取50μL的10XRT緩沖液,1μL的1MDTT和50μL的dNTP混合液,混勻,保存于–20°C.b.配制退火混合液:每個總RNA樣品如下比例配制于一個滅菌PCR管中:總RNA5.0μgRT引物(P)1μl無RNA酶的H2O加至總體積為10μl.用槍輕輕吸打混勻,離心于管底部.70°C孵育3分鐘,冷卻至37°C孵育10分鐘.c.配制RT混合液:當退火混合液37°C孵育時即可配制RT混合液RT混合液1張芯片2張芯片4張芯片緩沖液BN4μl8μl16μl無RNA酶的H2O4μl8μl16μlRNaseInhibitor1μl2μl4μlMMLVReverseTranscriptase1μl2μl4μl總體積10μl20μl40μlRT混合液37°C孵育1分鐘,進行下一步驟.d.RT反應:每張芯片實驗探針制備,需要加10μlRT混合液到10μl退火混合液中,槍輕輕吸打混勻,繼續(xù)在37°C孵育25分鐘,加熱至85°C孵育5分鐘水解RNA并使逆轉(zhuǎn)錄酶失