分子細胞遺傳學一

分子細胞遺傳學一第1頁/共30頁分子細胞遺傳學第2頁/共30頁第3頁/共30頁原位雜交(Insituhybridization)

1）同位素原位雜交(Isotopicinsituhybridization)

——70年代

2）非同位素原位雜交(Non-isotopicinsituhybridization)

——80年代中后期

（1）免疫酶聯(lián)

（2）熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH)

**同位素原位雜交的不足之處：

1）不穩(wěn)定；

2）低特異性；

3）高背景；

4）暴光時間長；

5）結(jié)果統(tǒng)計學處理繁瑣。

LichterP.CremerT.WardD.C.第4頁/共30頁FISH:(FluorescentInSituHybridization).

FISHisthedetectionofhighlyspecificDNAprobeswhichhavebeenhybridizedtoeitherinterphaseormetaphasechromosomesusingfluorescencemicroscopy.

DNAforprobeuseislabeledwithfluorescent(directmethod)ornonfluorescentmoleculeswhicharethendetectedbyfluorescentantibodies(indirectmethod).Theprobesbindtoaspecificregionorregionsonthetargetchromosome.Thechromosomesarethenstainedusingacontrastingcolor,andthecellsareviewedusingafluorescencemicroscope.

第5頁/共30頁第6頁/共30頁第7頁/共30頁**熒光原位雜交的特點：

1）快速；2）信號強；3）特異性高；4）多色。

**FISH有上述優(yōu)點的原因：

1）使用了熒光標記與檢測系統(tǒng)取代放射性標記與檢測系統(tǒng)

標記探針的物質(zhì)：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin)

——半抗原報告分子（間接標記）

（2）熒光物質(zhì)（直接標記）

Cy2或FluorX(綠色)/Cy3(橙色)/Cy3.5(猩紅色)/Cy5(紅色)/Aqua(蘭色)

間接標記的信號檢測（抗biotin或digoxigenin抗體上連接熒光物質(zhì)）物質(zhì)：

conjugatedtoavidinorantibodyofdigoxigenin

(1)Fluoresceinisothiocyanate(FITC)或Bidopy——綠色

(2)TexasRed,Rhodamine,——紅色

(3)AMCA——蘭色

染色體復染的物質(zhì):

PropidiumIodide(PI)（紅色），DAPI（蘭色），quinacrine（綠色），chromomycineA3（綠色）

第8頁/共30頁

第9頁/共30頁2）染色體“原位抑制”雜交（chromosomeinsitusuppression,CISS)

克服散在的重復序列造成的雜交背景，提高信號的特異性，在探針中加入過量的未標記的競爭性DNA(competitorDNA)，如humanCot-1DNA，進行雜交前的預(yù)復性。探針中的重復序列與加入的競爭物中的大量重復序列優(yōu)先復性，而特異性的單拷貝序列因競爭物中同源序列拷貝數(shù)少，絕大部分仍保持單鏈狀態(tài)。

**FISH技術(shù)的應(yīng)用

1）基因（或DNA片段）的染色體定位；

2）染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常的檢測；

3）間期細胞遺傳學（絨毛/羊水/精子/卵裂球/其它間期細胞研究與診斷）；

4）腫瘤遺傳學研究第10頁/共30頁**用于FISH的探針

1）單拷貝探針：

（1）種類：YAC，BAC，Cosmid，Plasmid，cDNA片段

（2）應(yīng)用

（a）定位DNA片段及嵌合體克隆驗證；

（b）確定染色體微小缺失與重復；

（c）染色體斷裂點分析。

（d）間期細胞染色體數(shù)目異常診斷。第11頁/共30頁左：DNA片段的染色體定位右：嵌合體檢出第12頁/共30頁FISH檢測微小缺失第13頁/共30頁染色體片段重復Dup19(p13.2-13.1ABABDirectDupNormalNormal第14頁/共30頁左圖：染色體斷裂點分析

——21號染色體長臂斷裂點精確定位

右圖：21q22.2BAC克隆在Down綜合征間期細胞中的雜交信號第15頁/共30頁BAC1D9on2p21DetectedAmplificationsonThyroidTumorCellLineWRO第16頁/共30頁2）簡單重復序列探針(simplerepetitiveprobes)

——異染色質(zhì)著絲粒探針(heterochromaticcentromerprobes)

其靶序列為α衛(wèi)星DNA或衛(wèi)星IIIDNA(alphasatellite/satelliteIIIDNA)多位于染色體的著絲粒和異染色質(zhì)區(qū)域，重復數(shù)百次至數(shù)千次。

特點：信號強

應(yīng)用：(a)標記染色體識別

(b)染色體數(shù)目異常檢測

(c)間期細胞遺傳學研究和臨床診斷

第17頁/共30頁第18頁/共30頁**間期細胞遺傳學的意義：

細胞分裂期僅占整個細胞周期的幾分之一至幾十分之一，經(jīng)細胞培養(yǎng)和相應(yīng)處理才能獲得染色體。人體的大部分細胞并不進行分裂，很難通過培養(yǎng)獲得中期染色體分裂相，間期FISH為這一時期遺傳物質(zhì)的研究提供了可能，而且快速。第19頁/共30頁3）染色體涂染探針(chromosomepaintingprobes)

整條染色體探針或染色體區(qū)帶特異性探針

探針來源：

（1）含有人單條染色體的人-嚙齒類(human-rodent)體細胞雜種組織融合的產(chǎn)物；

（2）熒光激活的流式細胞儀(fluorescence-activatedcellsorter,FACS)分離整條染色體DNA，并以載體克隆/PCR擴增；

（3）顯微切割得到染色體或染色體片段，PCR擴增；

染色體涂染方法：

（1）正向(forward)：正常probe雜交到待檢測的異常標本上；

（2）逆向(reverse)：分離異常染色體制備探針，雜交到正常標本上。

應(yīng)用（1）染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常分析；

（2）不同物種間的同源性比較；

（3）白血病及其它腫瘤的染色體診斷和研究。

**不能用于間期FISH第20頁/共30頁第21頁/共30頁FISH檢測（chromosomepainting)染色體易位第22頁/共30頁第23頁/共30頁4）多色FISH（muti-colorFISH)

多色復合染色體FISH探針(multiplexFISH,M-FISHprobes)

#兩種以上不同的非同位素標記，不同的熒光檢測系統(tǒng)，通過不同的濾光片組合或極少數(shù)幾種非同位素標記探針后，按照不同的比例混合，可以顯示多種顏色。

#采取結(jié)合或比率標記的方法進行標記探針。

在一套特殊的濾光片和計算機軟件系統(tǒng)輔助下，可制作24條染色體的彩色核型。

應(yīng)用：(a)染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常及斷裂點分析——多色FISH或M-FISH

(b)標記染色體識別——多色FISH或M-FISH

(c)不同種屬間基因組同源性比較——多色FISH

(d)多個DNA片段同時定位——多色FISH

**M-FISH不能檢測染色體內(nèi)的倒位、小片段缺失與重復。第24頁/共30頁多色FISHM-FISH技術(shù)第25頁/共30頁5）彩色顯帶FISH（Rx-FISH）探針

根據(jù)靈長類動物與人類基因組的同源性制作探針，使人類的24條染色體顯示出彩色帶型。第26頁/共30頁**比較基因組雜交(comparativeinsituhybridization)

探針位整個基因組DNA，而不是一個點或一個區(qū)域，主要用于確定未知區(qū)域的DNA擴增或缺失。特別是回避了實體腫瘤染色體制備的難題，是其它FISH方法難以替代的。但操作難度較大。

應(yīng)用：(a)腫瘤遺傳學研究——發(fā)現(xiàn)新的癌基因和抑癌基因；

(b)相關(guān)種屬間和同一種屬內(nèi)不同個體之間基因組差異；

(c)染色體不平衡片段識別和染色體重排研究。第27頁/共30頁比較基因組雜交(comparativegenomichybridizat