第3章-高效液相色譜1

1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法

高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，最高輸送壓力可達(dá)4.9107Pa.例如分別苯的羥基化合物，7個(gè)組分只需1min就可完成。對(duì)氨基酸分別，用經(jīng)典色譜法，柱長(zhǎng)約170cm，柱徑0.9cm，流淌相速度為30cm3·h-1，需用20多小時(shí)才能分別出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，接受梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分別出尿中104個(gè)組分.2．高效液相色譜法與氣相色譜法

（l）氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20％。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80％的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要接受高效液相色譜法進(jìn)行分別和分析。(2)氣相色譜接受流淌相是惰性氣體，它對(duì)組分沒(méi)有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。而高效液相色譜法中流淌相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對(duì)組分可產(chǎn)生確定親和力，并參與固定相對(duì)組分作用的猛烈競(jìng)爭(zhēng)。因此，流淌相對(duì)分別起很大作用，相當(dāng)于增加了一個(gè)限制和改進(jìn)分別條件的參數(shù)，這為選擇最佳分別條件供應(yīng)了極大便利。(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則常?？稍谑覝貤l件下工作?？傊?，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點(diǎn)，并用現(xiàn)代化手段加以改進(jìn)，因此得到迅猛的發(fā)展。目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類(lèi)、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分別和分析。高效液相色譜法的儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺點(diǎn)。2-2高效液相色譜儀

高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示看法圖3-1，一般可分為4個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分別系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。此外還配有協(xié)助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過(guò)程如下：首先高壓泵將貯液器中流淌相溶劑經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從限制器的出口流出。當(dāng)注入欲分別的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流淌相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分別，然后依先后依次進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來(lái)，由此得到液相色譜圖。

1．高壓輸液系統(tǒng)由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對(duì)流淌相阻力很大，為使流淌相較快流淌，必需配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過(guò)濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。對(duì)于一個(gè)好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于快速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點(diǎn)是在確定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變更無(wú)關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變更，故保留時(shí)間的重視性差，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵正漸漸取代恒壓泵。恒流泵又稱(chēng)機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。2．進(jìn)樣系統(tǒng)

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱(chēng)柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。

3分別系統(tǒng)——色譜柱梯度洗提色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長(zhǎng)5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。一般在分別前備有一個(gè)前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分別柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過(guò)前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過(guò)分別柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分別的性能不受影響。

4．檢測(cè)系統(tǒng)

在液相色譜中，有兩種基本類(lèi)型的檢測(cè)器。一類(lèi)是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分別組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類(lèi)檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。另一類(lèi)是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類(lèi)檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等?，F(xiàn)將常用的檢測(cè)器介紹如下:(1)紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器參比池樣品池光線硅光電池板

（2）熒光檢測(cè)器(3)示差折光率檢測(cè)器幾乎全部物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測(cè)器是一種通用型檢測(cè)器。靈敏度可達(dá)10-7g·cm-3。主要缺點(diǎn)是對(duì)溫度變更敏感，并且不能用于梯度淋洗。

（4）電導(dǎo)檢測(cè)器(5)附屬系統(tǒng)它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置.2-3高效液相色譜的固定相和流淌相（－）固定相高效液相色譜固定相以承受高壓實(shí)力來(lái)分類(lèi)，可分為剛性固體和硬膠兩大類(lèi)。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高壓，可制成直徑、形態(tài)、孔隙度不同的顆粒。假如在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛運(yùn)用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類(lèi)，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類(lèi)。1.表面多孔型固定相它的基體是實(shí)心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。表面活性材料為硅膠的固定相如國(guó)外的Zpax，CorasilI和II，Vydac，Pellosil以及上海試劑一廠的薄殼玻璃珠等；表面活性材料為氧化鋁的固定相，如Pellumina；為聚酰胺的，如Pellion。這類(lèi)固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對(duì)死體積小，出峰快速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱簡(jiǎn)潔，梯度淋洗時(shí)能快速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。2．全多孔型固定相它由直徑為10nm的硅膠微粒凝合而成。如國(guó)外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海試劑一廠的積累硅珠，青島海洋化工廠的YWG系列，天津試劑二廠的DG系列等。也可由氧化鋁微粒凝合成全多孔型固定相，如國(guó)外的LichrosorbALOXT。這類(lèi)固定相由于顆粒很細(xì)（5～10μm），孔仍舊較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特殊適合困難混合物分別及痕量分析.

（二）流淌相

由于高效液相色譜中流淌相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流淌相干脆影響組分的分別度。對(duì)流淌相溶劑的要求是：（1）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必需具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑要與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸取檢測(cè)器，應(yīng)留意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)。所謂溶劑的紫外截止波長(zhǎng)指當(dāng)小于截止波長(zhǎng)的輻射通過(guò)溶劑時(shí)，溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生猛烈吸取，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透亮的，它嚴(yán)峻干擾組分的吸取測(cè)量。表20-2列出了一些常用溶劑的紫外截止波長(zhǎng)。對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流淌相，以達(dá)最高靈敏度。（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對(duì)流淌相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長(zhǎng)值增加50～I(xiàn)OOnm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。(5)低粘度。若運(yùn)用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分別。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇、乙晴等。但粘度過(guò)于低的溶劑也不宜接受，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分別.2-4高效液相色譜法的主要類(lèi)型及選擇（－）液一液安排色譜法（LLPC）在液-液色譜中,流淌相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類(lèi)型的分別和分析，無(wú)論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。1．分別原理液液安排色譜的分別原理基本與液液萃取相同，都是依據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的安排系數(shù)。所不同的是液液色譜的安排是在柱中進(jìn)行的，使這種安排平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分別效率，從而能分別各種困難組分。

2固定相由于液液色譜中流淌相參與選擇競(jìng)爭(zhēng)，因此，對(duì)固定相選擇較簡(jiǎn)潔。只需運(yùn)用幾種極性不同的固定液即可解決分別問(wèn)題。例如，最常用的強(qiáng)極性固定液β，β′一氧二丙睛，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈?。為了更好解決固定液在載體上流失問(wèn)題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。它是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機(jī)械涂漬，因此它的產(chǎn)生對(duì)液相色譜法快速發(fā)展起著重大作用，可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個(gè)重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有3/4以上的分別問(wèn)題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。3．流淌相在液液色譜中為了避開(kāi)固定液的流失。對(duì)流淌相的一個(gè)基本要求是流淌相盡可能不與固定相互溶，而且流淌相與固定相的極性差別越顯著越好。依據(jù)所運(yùn)用的流淌相和固定相的極性程度，將其分為正相安排色譜和反相安排色譜。

假如接受流淌相的極性小于固定相的極性，稱(chēng)為正相安排色譜，它適用于極性化合物的分別。其流出依次是極性小的先流出，極性大的后流出。

假如接受流淌相的極性大于固定相的極性，稱(chēng)為反相安排色譜。它適用于非極性化合物的分別，其流出依次與正相色譜恰好相反。（二）化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）

接受化學(xué)鍵合相的液相色譜稱(chēng)為化學(xué)鍵合相色譜法，簡(jiǎn)稱(chēng)鍵合相色譜。由于鍵合固定相特別穩(wěn)定，在運(yùn)用中不易流失，適用于梯度淋洗，特殊適用于分別容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此它適用于種類(lèi)繁多樣品的分別。1．鍵合固定相類(lèi)型用來(lái)制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機(jī)分可成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類(lèi)（1）疏水基團(tuán)如不同鏈長(zhǎng)的烷烴（C8和C18）和苯基等（2）極性基團(tuán)如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）離子交換基團(tuán)如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季鍍鹽；作為陽(yáng)離子交換基團(tuán)的磺酸等.2．鍵合固定相的制備（l）硅酸酯（≡Si一OR）鍵合固定相,它是最先用于液相色譜的健合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)：≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20由于這類(lèi)鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性,但這些酯化過(guò)的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流淌相。（2）≡Si－C或Si一N共價(jià)鍵合固定相制備反應(yīng)如下共價(jià)鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點(diǎn)是格氏反應(yīng)不便利；當(dāng)運(yùn)用水溶液時(shí)，必需限制pH在4～8范圍內(nèi).（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）鍵合固定相制備反應(yīng)如下：這類(lèi)鍵會(huì)固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。能在70℃以下，pH=2～8范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛.3．反相健合相色譜法

此法的固定相是接受極性較小的鍵合固定相，如硅膠一C18H37、硅膠一苯基等；流淌相是接受極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇一水、乙睛一水、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖溶液等。它多用于分別多環(huán)芳烴等低極性化合物；若接受含確定比例的甲醇或乙睛的水溶液為流淌相，也可用于分別極性化合物；若接受水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流淌相，則可分別一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類(lèi)等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無(wú)拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)于反相鍵合相色譜的分別機(jī)理，可用所謂疏溶劑作用理論來(lái)說(shuō)明。這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強(qiáng)的流水特性。當(dāng)用極性溶劑為流淌相來(lái)分別含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分別物的極性部分受到極性流淌相的作用，促使它離開(kāi)固定相，并減小其保留作用（見(jiàn)圖20-4）。明顯，兩種作用力之差，確定了分子在色譜中的保留行為。

一般地，固定相的烷基協(xié)作基或分別分子中非極性部分的表面積越大，或者流淌相表面張力及介電常數(shù)越大，則締合作用越強(qiáng)，安排比也越大，保留值越大。

在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。4.正相鍵合相色譜法

此法是以極性的有機(jī)基團(tuán)，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類(lèi)）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為流淌相，分別極性化合物。

一般認(rèn)為正相色譜的分別機(jī)制屬于安排色譜。組分的安排比K值，隨其極性的增加而增大，但隨流淌相中極性調(diào)整劑的極性增大（或濃度增大）而降低。同時(shí)，極性鍵合相的極性越大，組分的保留值越大。

這種色譜方法主要用于分別異構(gòu)體、極性不同的化合物，特殊適用于分別不同類(lèi)型的化合物。5.離子性鍵合相色譜法

當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，如一SO3H一CH2NH2、－C00H、一CH2N（CH3）等時(shí)，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流淌相一般接受緩沖溶液。其分別原理與離子交換色譜類(lèi)同。以上探討了各種類(lèi)型化學(xué)鍵合相色譜法，歸納鍵合相色譜的最大優(yōu)點(diǎn)是：(1)通過(guò)變更流淌相的組成和種類(lèi)，可有效地分別各種類(lèi)型化合物（非極性、極性和離子型）(2)由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易流失，特殊適用于梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在高效液相色譜法中，約有8O％的分別問(wèn)題是用鍵合相色譜法解決。此法的最大缺點(diǎn)是不能用于酸、堿度過(guò)大或存在氧化劑的緩沖溶液作流淌相的體系。如何依據(jù)樣品極性種類(lèi)來(lái)選擇化學(xué)鍵合的固定相，請(qǐng)參看表20-3。

（三）液一固吸附色譜法(LSAC)

液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)是依據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來(lái)進(jìn)行分別的。1．分別原理當(dāng)流淌相通過(guò)固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流淌相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流淌相帶入柱內(nèi)，只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤写_定程度的保留就要取代數(shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧魈氏嗳軇┓钟茫┯谑?，在固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附:X+nSad=Xad+nS

達(dá)平衡時(shí),有其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分別。Kad值可通過(guò)吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。2．固定相

吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料勻整、粒度小?？籽\的優(yōu)點(diǎn)，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛運(yùn)用的還是全多孔型微粒填料。3流淌相一般把吸附色譜中流淌相稱(chēng)作洗脫劑。在吸附色譜中對(duì)極性大的試樣往往接受極性強(qiáng)的洗脫劑；對(duì)極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（ε0）來(lái)衡量。ε0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。表20-4列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的ε0值。在硅膠吸附劑中ε0值的依次相同，數(shù)值可換算（ε0硅膠=0·77×ε0氧化鋁）。(四）離子交換色譜法（IEC）

此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分別分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分別。它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分別，亦可用于有機(jī)物的分別，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。1．離子交換原理離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分別的。其固定相接受離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹(shù)脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：陽(yáng)離子交換：陰離子交換：

一般形式：R一A＋B＝R－B＋A達(dá)平衡時(shí)，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：

式中[A]r，[B]r分別代表樹(shù)脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（B）的濃度，[A]、[B]則代表它們?cè)谌芤褐械臐舛?。離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)見(jiàn)從表示試樣離子B對(duì)于A型樹(shù)脂親和力的大?。篕B/A越大，說(shuō)明B離子交換實(shí)力越大，越易保留而難于洗脫。一般說(shuō)來(lái)，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。

對(duì)于典型的磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，一價(jià)離子的KB/A值按以下依次：Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二價(jià)離子的依次為：Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+對(duì)于季鋁型強(qiáng)堿陰離子交換樹(shù)指，各陰離子的選擇性依次為：ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－2．固定相作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類(lèi)：合成樹(shù)脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽(yáng)離子和陰離子之分。再依據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分（見(jiàn)表20-5）

常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：（l）多孔型離子交換樹(shù)脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為5～20μm，有微孔型和大孔型之分[見(jiàn)圖20-6中（a）和（b）］。（2）薄膜型離子交換樹(shù)脂它是在直徑約對(duì)30μm的固體情性核上，凝合1～2μm厚的樹(shù)脂層，如圖20-6中（c）。（3）表面多孔型離子交換樹(shù)脂它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹(shù)脂，如圖20-6中（d）所示。（4）離子交換鍵合固定相它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類(lèi)型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點(diǎn)是機(jī)械性能穩(wěn)定，可運(yùn)用小粒度固定相和高柱壓來(lái)實(shí)現(xiàn)快速分別。3．流淌相離子交換色譜法所用流淌相大都是確定pH和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）的緩沖溶液。通過(guò)變更流淌相中鹽離子的種類(lèi)、濃度和pH值可限制k值，變更選擇性。假如增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競(jìng)爭(zhēng)吸附實(shí)力，從而降低其在固定相上的保留值。一般，對(duì)于陰離子交換樹(shù)脂來(lái)說(shuō)，各種陰離子的滯留次序?yàn)椋簷幟仕犭x子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。陽(yáng)離子的滯留次序大為：Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十但差別不如陰離子明顯。關(guān)于pH值的影響，要視不同狀況而定。例如，分別有機(jī)酸和有機(jī)堿時(shí)，這些酸堿的離解程度可通過(guò)變更流淌相的pH值來(lái)限制。增大pH值會(huì)使酸的電離度增加，使堿的電離度削減；降低PH值，其結(jié)果相反。但無(wú)論屬于哪種狀況，只要電離度增大，就會(huì)使樣品的保留增大。（五）離子色譜法（IC）

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來(lái)的一種分別方法。由于離子交換色譜法在無(wú)機(jī)離子的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對(duì)于那些不能接受紫外檢測(cè)器的被測(cè)離子，如接受電導(dǎo)檢測(cè)器，由于被測(cè)離子的電導(dǎo)信號(hào)被強(qiáng)電解質(zhì)流淌相的高背景電導(dǎo)信號(hào)掩沒(méi)而無(wú)法檢測(cè)。為了解決這一問(wèn)題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測(cè)定多種無(wú)機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)。他們?cè)陔x子交換分別柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分別柱電荷相反的離子交換樹(shù)脂。通過(guò)分別柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流淌相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流淌相，從而用電導(dǎo)檢測(cè)器可干脆檢測(cè)各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱(chēng)為離子色譜。若樣品為陽(yáng)離子，用無(wú)機(jī)酸作流淌相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽(yáng)離子交換劑的分別往后，隨流淌相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反應(yīng)：R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-由反應(yīng)可見(jiàn)：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消退了流淌相本底電導(dǎo)的影響。同時(shí)，又將樣品陽(yáng)離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2．6倍，提高了所測(cè)陽(yáng)離子電導(dǎo)的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于陰離子樣品也有相像的作用機(jī)理。在分別柱后加一個(gè)抑制柱的離子色譜亦稱(chēng)為抑制型離子色譜或稱(chēng)雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過(guò)抑制柱后會(huì)加寬，降低了分別度。后來(lái)，F(xiàn)rits等人提出不接受抑制柱的離子色譜體系，而接受了電導(dǎo)率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流淌相，稱(chēng)為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。（六）離子對(duì)色譜法（IPC）

離子對(duì)色譜法是分別分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的極好方法。它是離子對(duì)技術(shù)與色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物。在20世紀(jì)7O年頭中期，Schill等人首先提出離子對(duì)色譜法，后來(lái)，這種方法得到特別快速的發(fā)展。1．離子對(duì)色譜法原理離子對(duì)色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱(chēng)對(duì)離子或反離子）加到流淌相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對(duì)，從而限制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。關(guān)于離子對(duì)色譜機(jī)理，至今仍不特別明確，已提出三種機(jī)理：離子對(duì)形成機(jī)理；離子交換機(jī)理；離子相互作用機(jī)理?，F(xiàn)以離子對(duì)形成機(jī)理說(shuō)明之。假如有一離子對(duì)色譜體系，固定相為非極性鍵合相，流淌相為水溶液，并在其中加入一種電荷與組分別子A-相反的離子B+，B+離子由于靜電引力與帶負(fù)電的人組分別子生成離子對(duì)化合物A-B+。離子對(duì)生成反應(yīng)式由于離子對(duì)化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相（有機(jī)相）提取。組分別子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對(duì)的實(shí)力大小不同以及形成的離子對(duì)流水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分別子在固定相中滯留時(shí)間不同，因而出峰先后不同。這就是離子對(duì)色譜法分別的基本原理。

2．鍵合相反相離子對(duì)色譜法離子對(duì)色譜法類(lèi)型很多，依據(jù)流淌相和固定相的極性可分為反相離子對(duì)和正相離于對(duì)色譜法。其中以鍵合相離子對(duì)色譜法最重要。這種色譜法的固定相接受非極性的疏水鍵合相［如十八烷基鍵合相（ODS）等］，流淌相為加有平衡離子（反離子）的極性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。依據(jù)離子對(duì)生成反應(yīng)式，平衡常數(shù)KAB可表示為依據(jù)定義，溶質(zhì)的安排系數(shù)依據(jù)上兩式，有式中β為相比率。容量因子k隨KAB和[B+]水相的增大而增大。鍵合相反相離子對(duì)色譜法操作簡(jiǎn)便，只要變更流淌相的pH值、平衡離子的濃度和種類(lèi)，就可在較大范圍內(nèi)變更分別的選擇性，能較好解決難分別混合物的分別問(wèn)題。此法發(fā)展快速，應(yīng)用較廣泛.（七）尺寸排阻色譜法（SEC）尺寸排阻色譜法又稱(chēng)凝膠色譜法，主要用于較大分子的分別。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、安排和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形態(tài)不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分別的。尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，即用來(lái)分析大分子物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布。它具有其他液相色譜所沒(méi)有的特點(diǎn)：（1）保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，有可能供應(yīng)分子結(jié)構(gòu)的某些信息。(2)保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)，可接受靈敏度較低的檢測(cè)器（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長(zhǎng)。（4）不能辨別分子大小相近的化合物，相對(duì)分子質(zhì)量差別必需大于10％才能得以分別。

1．分別原理尺寸排阻色譜是按分子大小依次進(jìn)行分別的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)——凝膠，它類(lèi)似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有確定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最終洗精彩譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過(guò)程模型見(jiàn)圖20-7。2．固定相排阻色譜固定相種類(lèi)很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類(lèi)。表20-6列出了常用的一些固定相。所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的松軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。（1）軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的很多倍。它們適用以水溶性溶劑作流淌相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。（2）半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流淌相。用于高效液相色譜時(shí)，流速不宜大。（3）剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流淌相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。一般限制壓強(qiáng)小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分別。3．流淌相

排阻色譜所選用的流淌相必需能溶解樣品，并必需與凝膠本身特別相像，這樣才能潤(rùn)濕凝膠。當(dāng)接受軟性凝膠時(shí)，溶劑也必需能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小，因?yàn)楦哒扯热軇┩拗品肿訑U(kuò)散作用而影響分別效果。這對(duì)于具有低擴(kuò)散系數(shù)的大分子物質(zhì)分別，尤需留意。選擇溶劑還必需與檢定器相匹配。常用的流淌相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

以水溶液為流淌相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機(jī)溶劑為流淌相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。(八)親和色譜法（AC）簡(jiǎn)介

親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分別的一種方法。它通常是在載體（無(wú)機(jī)或有機(jī)填料）表面先鍵合一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂（如環(huán)氧、聯(lián)氨等）；隨后，再連接上配基（酶、抗原或激素等）。這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，沒(méi)有這種作用的分子不被保留。圖20-9為親和色譜法示意圖。

（九）分別類(lèi)型的選擇1．依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇相對(duì)分子質(zhì)量特別低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類(lèi)型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對(duì)分子質(zhì)量范圍是20O～2000。對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。2．依據(jù)溶解度選擇弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。假如樣品可溶于水并屬于能離解物質(zhì)，以接受離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類(lèi)（如苯或異辛烷），則可采

表20-7液相色譜分別類(lèi)型選擇參考表