毛細管電泳法專家講座

第4節(jié)毛細管電泳1毛細管電泳法第1頁4.1、概述4.2、理論基礎4.3、毛細管電泳儀4.4、毛細管電泳分離模式4.5、毛細管電泳應用2毛細管電泳法第2頁4.1、概述

在電解質溶液中，位于電場中帶電離子在電場力作用下，以不一樣速度向其所帶電荷相反電極方向遷移現(xiàn)象，稱之為電泳。因為不一樣離子所帶電荷及性質不一樣，遷移速率不一樣，可實現(xiàn)分離。樣品遷移速度和方向由其電荷和淌度決定。

1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取蛋白質混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；1948年，獲諾貝爾化學獎；3毛細管電泳法第3頁利用電泳現(xiàn)象對化學或生物物質進行分離分析方法和技術叫電泳法或電泳技術。

按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，所用分離柱柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠低于HPLC），溫度影響大。4.1.1、經典電泳分析方法4毛細管電泳法第4頁

1981年，Jorgenson等用75m內徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，快速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美嶄新分離分析技術——高效毛細管電泳。4.1.2、毛細管電泳分析方法5毛細管電泳法第5頁高效毛細管電泳在技術上采取了兩項主要改進：一、采取了<0.1mm內徑毛細管二、采取了高達數(shù)萬伏電壓毛細管采取使產生熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應，使電場電壓能夠很高。

電壓升高，電場推進力大，又可深入使柱徑變小，柱長增加。高效毛細管電泳柱效遠高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達幾十萬/米，特殊柱子能夠到達數(shù)百萬。6毛細管電泳法第6頁分離過程

電場作用下，毛細管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。

帶電粒子遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度矢量和。

正離子：兩種效應運動方向一致，在負極最先流出；

中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應運動方向相反。ν電滲流>ν電泳時，陰離子在負極最終流出。7毛細管電泳法第7頁高效毛細管電泳特點1、儀器簡單、易自動化電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2、分析速度快、分離效率高

可在3.1min內分離36種無機及有機陰離子，4.1

min內分離了24種陽離子；分離柱效：105～107/m理論塔板數(shù)3、操作方便、消耗少、成本低進樣量極少，nL水平4、環(huán)境友好5、應用范圍極廣

無機物、有機物、生物小分子、中性分子；生物大分子等

8毛細管電泳法第8頁4.2、理論基礎4.2.1電泳

電泳是指帶電離子在電場中定向移動，不一樣離子含有不一樣遷移速度，遷移速度與哪些原因相關？當帶電離子以速度ν在電場中移動時，受到大小相等、方向相反電場推進力和平動摩擦阻力作用。電場力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—離子所帶有效電荷；E—電場強度；ν—離子在電場中遷移速度；f—平動摩擦系數(shù)9毛細管電泳法第9頁（球形離子）

η-溶液粘度r-離子半徑物質離子在電場中差速遷移是電泳分離基礎。淌度μ：單位電場強度下平均電泳速度:所以，遷移速度：10毛細管電泳法第10頁4.2.2、電滲現(xiàn)象與電滲流1、電滲流現(xiàn)象

當固體與液體接觸時，固體表面因為某種原因帶一個電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。

當液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固體表面移動，這種液體相對于固體表面移動現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。電滲現(xiàn)象中整體移動著液體叫電滲流（electroosmoticflow，EOF）。11毛細管電泳法第11頁2、HPCE中電滲現(xiàn)象與電滲流

石英毛細管柱，內充液pH>3時，表面電離成-SiO-，管內壁帶負電荷，形成雙電層。

在高電場作用下，帶正電荷溶液表面及擴散層向陰極移動，因為這些陽離子實際上是溶劑化，故將引發(fā)柱中溶液整體向負極移動，速度νEOF。12毛細管電泳法第12頁

電滲流方向取決于毛細管內表面電荷性質：石英毛細管，內表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向方法：（1）毛細管改性表面鍵合陽離子基團；（2）加電滲流反轉劑內充液中加入大量陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷。電滲流流向陽極。3、HPCE中電滲流方向13毛細管電泳法第13頁

電滲流大小用電滲流速度νEOF表示，取決于電滲淌度μ和電場強度E。即

νEOF=μE電滲淌度取決于電泳介質及雙電層Zeta電勢，即

μ=ε0εξε0—真空介電常數(shù)；ε—介電常數(shù)；ξ—毛細管壁Zeta電勢。νEOF=ε0εξE實際電泳分析，可在試驗測定對應參數(shù)后，按下式計算

νEOF=Lef/teoLef—毛細管有效長度；teo—電滲流標識物（中性物質）遷移時間。4、HPCE中電滲流大小14毛細管電泳法第14頁5、HPCE中電滲流流形

電荷均勻分布，整體移動，電滲流流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很小）；液相色譜中溶液流動為層流，拋物線流型，管中心處速度為平均速度2倍（引發(fā)譜帶展寬較大）。15毛細管電泳法第15頁6、HPCE中電滲流作用各種電性離子在毛細管柱中遷移速度為：

ν+=νEOF+ν+ef陽離子運動方向與電滲流一致；ν-=νEOF-ν-ef陰離子運動方向與電滲流相反；ν0=νEOF中性粒子運動方向與電滲流一致；普通離子電滲速度是電泳速度5-7倍，所以待測組分都能從陰極流出。（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子分離；（2）改變電滲流大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中流速；（3）電滲流微小改變影響結果重現(xiàn)性；在HPCE中，控制電滲流非常主要。16毛細管電泳法第16頁4.2.3、

HPCE中影響電滲流原因1.電場強度影響

電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細管材料影響

不一樣材料毛細管表面電荷特征不一樣，產生電滲流大小不一樣。17毛細管電泳法第17頁3.電解質溶液性質影響（1）溶液pH影響

對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大；pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時，采取緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。（2）陰離子影響

陰離子不一樣時，毛細管中電流有較大差異，產生焦耳熱不一樣。

緩沖溶液離子強度，影響雙電層厚度、溶液黏度和工作電流，顯著影響電滲流大小。緩沖溶液離子強度增加，電滲流下降。18毛細管電泳法第18頁19毛細管電泳法第19頁4.溫度影響

毛細管內溫度升高，使溶液黏度下降，電滲流增大。溫度改變來自于“焦耳熱”；焦耳熱：毛細管溶液中有電流經過時，產生熱量；HPCE中焦耳熱與背景電解質摩爾電導、濃度及電場強度成正比。溫度每改變1K，將引發(fā)背景電解質溶液黏度改變2%～3%；20毛細管電泳法第20頁5.添加劑影響（1）加入濃度較大中性鹽，如K2SO4，溶液離子強度增大，電滲流減小。（2）加入表面活性劑，可改變電滲流大小和方向；加入陽離子表面活性劑可改變電滲流方向。

（3）加入有機溶劑可改變電滲流大小。21毛細管電泳法第21頁4.2.4、淌度

淌度：帶電離子在單位電場下遷移速度；淌度不一樣是電泳分離基礎。1.有效淌度(effectivemobility)μef溶液中離子電泳淌度μef=∑aiμi（不考慮電滲流）

ai—溶質i解離度；μi—溶質i在解離狀態(tài)下絕對淌度2.表觀淌度μap離子在實際分離過程中遷移速度（表觀遷移速度）：

νap=μapE

μap=μef+μEOF22毛細管電泳法第22頁4.2.5、

HPCE中參數(shù)與關系式

1.遷移時間（保留時間）

HPCE兼含有電化學特征和色譜分析特征。相關色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細管總長度；2.分離效率（塔板數(shù)）

在HPCE中，僅考慮縱向擴散，σ2=2Dt

擴散系數(shù)小溶質比擴散系數(shù)大分離效率高，分離生物大分子依據(jù)。23毛細管電泳法第23頁3.分離度

影響分離度主要原因；工作電壓V；毛細管有效長度與總長度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計算：24毛細管電泳法第24頁4.2.6、影響分離效率原因—區(qū)帶展寬1.縱向擴散影響

在HPCE中，縱向擴散引發(fā)峰展寬：σ2=2Dt由擴散系數(shù)和遷移時間決定。大分子擴散系數(shù)小，可取得更高分離效率，大分子生物試樣分離依據(jù)。2.進樣影響

當進樣塞長度太大時，引發(fā)峰展寬大于縱向擴散。分離效率顯著下降；實際操作時進樣塞長度小于或等于毛細管總長度1%～2%。25毛細管電泳法第25頁3.焦耳熱與溫度梯度影響

電泳過程產生焦耳熱可由下式計算：m—電解質溶液摩爾電導；I—工作電流：cm—電解質濃度；散熱過程中，在毛細管內形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，造成區(qū)帶展寬。改進方法：（1）減小毛細管內徑；（2）控制散熱；26毛細管電泳法第26頁4.溶質與管壁間相互作用

存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬；蛋白質、多肽帶電荷數(shù)多，有較多疏水基，吸附問題尤其嚴重，是當前分離分析該類物質一大難題。細內徑毛細管柱，首先有利于散熱，另首先比表面積大，又增加了溶質吸附機會。

27毛細管電泳法第27頁4.3、毛細管電泳儀4.3.1、儀器流程與主要部件

電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導熒光檢測器；激光誘導熒光檢測器可檢測到：10-19～10-21mol28毛細管電泳法第28頁1.高壓電源（1）0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調直流電源；（2）含有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉換；2.毛細管柱

（1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學、機械性能差；外涂覆聚酰亞胺保護層。檢測窗口制作。（2）規(guī)格：內徑25～100μm，外徑150～400μm；長度<=1m29毛細管電泳法第29頁3.緩沖液池

化學惰性，機械穩(wěn)定性好；4.檢測器

要求：含有極高靈敏度，可柱端檢測；檢測器、數(shù)據(jù)采集與計算機數(shù)據(jù)處理一體化；

類型檢測限/mol特點紫外-可見

10-13～10-15

加二極管陣列，光譜信息熒光

10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導熒光10-18～10-21靈敏度極高，樣品需衍生電化學

10-17～10-19樣品需有電活性30毛細管電泳法第30頁4.3.2、毛細管電泳進樣方式

進樣量：毛細管長度1%-2%；納升級、非常??；1.流體力學進樣方式

（1）進樣端加壓（2）出口端抽真空（3）虹吸進樣31毛細管電泳法第31頁

毛細管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動進樣方式

進樣不均：電歧視現(xiàn)象，淌度大離子比淌度小進樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反離子可能進不去；尤其適合黏度大試樣；

32毛細管電泳法第32頁4.4、毛細管電泳分離模式4.4.1、毛細管區(qū)帶電泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子遷移速度=電泳和電滲流速度矢量和。正離子：兩種效應運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應運動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最終流出,在這種情況下,不但能夠按類分離,同種類離子因為差速遷移被相互分離。最基本、應用最廣分離模式；33毛細管電泳法第33頁

1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度到達臨界濃度，形成一疏水內核、外部帶電膠束。4.4.2、膠束電動毛細管色譜

micellarelectrokineticchromatography，MEKC

在電場力作用下，膠束在柱中移動。加入十二烷基磺酸鈉34毛細管電泳法第34頁

2.電泳流和電滲流方向相反，且ν電滲流

>ν電泳，負電膠束以較慢速度向