Westernblot實驗步驟說明

Westernblot原理WesternBlot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳分離蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)過SDS分離的蛋白質(zhì)被到轉(zhuǎn)移到固相支撐物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持膜上蛋白質(zhì)或多肽的抗原性質(zhì)不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與其對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測特異蛋白質(zhì)表達水平。由于Westernblot檢測技術(shù)具有簡便，快捷等特點，所以目前該技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達水平的檢測。WesternBlot信號放大基本原理經(jīng)過SDS分離的蛋白質(zhì)、多肽等被轉(zhuǎn)移到固相支持膜上，然后用蛋白質(zhì)或多肽特異性的抗體來檢測一級信號放大二級信號放大一抗抗原抗原一抗二抗WesternBlot一般流程底片掃描、分析底物顯色二抗孵育一抗孵育封閉轉(zhuǎn)膜SDS電泳蛋白樣品的制備WesternBlot基本實驗步驟1、蛋白質(zhì)提?。篧IP或RIPA裂解細胞或研磨組織，離心，收集上清。2、蛋白定量：先總蛋白定量，western后在依據(jù)內(nèi)參定量。3、電泳：依據(jù)需要檢測蛋白的分子量選取膠的濃度，制膠，電泳。4、轉(zhuǎn)膜：半干或濕轉(zhuǎn)，應(yīng)用半干法轉(zhuǎn)膜需防止短路。5、封閉：5%脫脂奶粉或BSA封閉過夜或室溫1小時。6、一抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋一抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時或4度過夜，1xTBST洗膜3次，每次5分鐘。7、二抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時，1xTBST，洗膜3次，每次5分鐘。8、顯影(ECL法)：將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合均勻滴在膜上。置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干。9、圖片分析：標(biāo)定Marker，進行分析與掃描。貼壁細胞：細胞可以在培養(yǎng)皿里裂解，洗掉培養(yǎng)基，PBS洗2~3次，加入RIPA裂解液裂解，以可以將細胞消化下來，離心，PBS洗2~3次，加入RIPA冰上裂解液裂解30分鐘（可提高蛋白濃度）。按6孔板100-200微升/孔的比例加入PIPA(可根據(jù)細胞多少調(diào)節(jié)裂解液體積）,4度，12000轉(zhuǎn)，離心15分鐘，收集上清.懸浮細胞:收集培養(yǎng)細胞，離心去除培養(yǎng)液，用PBS洗2-3遍，按6孔板加入100-200微升/孔的比例加入RIPA，用搶懸浮細胞。如果細胞數(shù)量較大，應(yīng)按50-100萬細胞/管分裝或根據(jù)細胞數(shù)量按比例增加RIPA的用量，裂解完全時應(yīng)無明顯的細胞顆粒。4度，12000轉(zhuǎn)，離心15分鐘，收集上清.組織樣品：液氮研磨組織，按每20毫克組織加100-200微升的比例加入RIPA,冰上裂解30分鐘，4度，12000轉(zhuǎn)，離心30分鐘，收集上清.蛋白樣品的制備蛋白樣品的定量

Bradford法測定蛋白濃度原理：此法基于考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定。反應(yīng)化合物在595nm處有最大光吸收值，化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系?？捡R斯亮蘭溶液的配制：稱取100mg考馬斯亮藍G250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%(W/V)磷酸，將溶液用水稀釋到1000mL，過濾。試劑的終濃度為0.01%考馬斯亮藍G250，4.7%(W/V)乙醇，和8.5%(W/V)磷酸。實驗步驟：96孔板，對照20μlPBS,測定蛋白樣品:18μl+2μl蛋白，加入200μl考馬斯亮蘭溶液，放置2分鐘（在一個小時內(nèi)測，時間變長，可能會產(chǎn)生沉淀），酶標(biāo)儀上595nm處測定吸光值，這樣只能相對定量蛋白，如果要定量蛋白，可以用不同梯度的BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量蛋白SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：

SDS是一種陰離子表面活性劑.當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之SDS后,由于SDS帶強負價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價一致(chargedensity),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

電泳注意：（1）所有蛋白樣品定量一致，體積以一致，不夠的用裂解液補滿，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1×loadingbuffer上樣，Marker也用1×loadingbuffer調(diào)整至與樣品等體積，這樣可以避免最邊上的孔道電泳時出現(xiàn)擴散，使最邊上的孔道電泳出現(xiàn)誤差。（2）WesternBlot一般上樣30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時間都有關(guān)系，也與顯色時間長短有關(guān)。開始摸條件時，為了拿到陽性結(jié)果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當(dāng)然背景也就出來了。（3）濃縮膠的目的使得loading的樣品能夠在同一條水平線上進入分離膠，如果電壓太大前端的蛋白容易在后面的蛋白趕上來前進入分離膠。而在分離是理論上小電壓長時間分離的效果會更好，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑得很好，同時制膠前一定要使膠混勻，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠，使膠不均勻。轉(zhuǎn)膜PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差，背景相對叫弱。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好，但背景相對叫強。分類：半干法和濕法轉(zhuǎn)移是兩種不同的轉(zhuǎn)移裝置下的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將膜，膠，濾紙整個浸泡在buffer的Tank里轉(zhuǎn)移的，叫濕法；用濾紙吸buffer來做轉(zhuǎn)移體系的叫半干法。BIO-RAD的半干轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的弱點就是無法控溫，當(dāng)電流過高，而系統(tǒng)的散熱又比較差，濾紙的吸水性比較差的情況下，就很容易燒膠。轉(zhuǎn)膜半干實驗步驟：先將PVDF膜在甲醇中浸泡約30s,在放入轉(zhuǎn)膜緩沖液里浸泡數(shù)分鐘。每塊膠用60mA，1h，從下到上的順序：陰極/濾紙/PVDF膜/凝膠/濾紙,凝膠面向陰極，保持濕潤和沒有氣泡。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶轉(zhuǎn)移到膜上的效率。

濕轉(zhuǎn)實驗步驟：將膜，凝膠放置到濕轉(zhuǎn)夾子中，膜面向正極，凝膠面向負極，100V穩(wěn)壓轉(zhuǎn)膜1.5小時，時間和電壓可以根據(jù)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)分子量進行相應(yīng)調(diào)整，轉(zhuǎn)膜后麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶轉(zhuǎn)移到膜上的效率。封閉原理：脫脂奶粉中主要是乳清蛋白和酪蛋白。原理就是用非抗原的蛋白去封閉膜，避免標(biāo)記抗體固定在膜上引起背景增高，即脫脂奶粉中的蛋白通過疏水作用與膜上沒有蛋白的部分結(jié)合，從而可以阻止一抗與膜通過疏水作用結(jié)合而產(chǎn)生很高的背景。種類：常用的封閉液有bovineserumalbumin(BSA),non-fatmilk,casein,gelatin,tween-20等,一般用non-fatmilk.實驗步驟：

5%脫脂奶粉（用1xTBS配制，或1xTBST配制）封閉過夜或室溫1~2小時。一抗、二抗孵育1：原理：一抗可以與要檢測的蛋白特異結(jié)合，二抗可與一抗結(jié)合，同時二抗上帶有特異的酶（如辣根過氧化物酶HRP，堿性磷酸酶法AP,化學(xué)發(fā)光顯色法HRP),此酶可以分解底物使膠片感光。2：實驗步驟：一抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋一抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時或4度過夜（抗體濃度及孵育時間需根據(jù)不同的抗體做相應(yīng)調(diào)整，1xTBST，洗膜3次，每次5分鐘

二抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時，